翻訳制御とタンパク質 | Chuzhou Research Chemical Inc.

Communications Biology volume 6、記事番号: 616 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

TREM2 は、ミクログリアおよびマクロファージで発現される膜貫通受容体です。これらの細胞におけるTREM2レベルの上昇は、アルツハイマー病などの加齢に伴う病理学的状態に関連しています。しかし、TREM2 のタンパク質発現の根底にある制御機構は不明のままです。この研究では、翻訳におけるヒト TREM2 の 5' 非翻訳領域 (5'-UTR) の役割を明らかにしました。 TREM2 の 5'-UTR の上流開始コドン (uAUG) は、ヒトを含む一部の霊長類に特異的です。従来の TREM2 タンパク質の発現は、下流の AUG (dTREM2) から始まり、uAUG を介して 5'-UTR によって抑制されます。また、プロテアソームによって大部分が分解される uAUG (uTREM2) から始まる TREM2 タンパク質アイソフォームも検出します。最後に、5'-UTR はアミノ酸飢餓に応答した dTREM2 発現の下方制御に不可欠です。まとめると、我々の研究は、TREM2 翻訳における 5'-UTR の種特異的な調節的役割を特定します。

骨髄細胞 2 上に発現したトリガー受容体 (TREM2) は、脂質感知受容体として機能する膜貫通タンパク質です1。 TREM2 は主に脳内のミクログリアで発現します。さらに、ミクログリアの食作用、シナプス刈り込み、炎症反応にも関与しています2、3、4。 TREM2 のまれな変異体は、アルツハイマー病 (AD) のリスクを高めることが示されています 5,6。さらに、TREM2 のホモ接合性変異は、若年性認知症と骨嚢胞を特徴とする希少疾患である那須ハコラ病を引き起こします7。 TREM2 の疾患関連変異体は、ミクログリアの基質特異的機能と生存を損ないます 8。対照的に、TREM2 の発現上昇または TREM2 の抗体媒介活性化は、AD モデルマウスの一部の疾患表現型を回復します9,10。 TREM2 は、恒常性ミクログリアから疾患関連ミクログリア状態への移行に不可欠です 11。その発現は、腫瘍関連マクロファージおよび脂質関連マクロファージもマークします12、13。したがって、TREM2 は、AD9、10、11、がん 12、肥満 13 などの加齢に関連した症状に関与していると考えられています。 TREM2 の細胞機能は実証されていますが、TREM2 の制御機構は依然として解明されていません。

タンパク質の適切な発現レベルは、5' 非翻訳領域 (UTR) などの非コード要素によって決定されます 14。上流 AUG (uAUG) は、ヒトとげっ歯類の間で進化的に保存された 5'-UTR の特徴です 15。 uAUG は、リボソームのスキャニングを妨害するか、ナンセンス媒介 mRNA 分解を誘導することによって、下流のメイン ORF (オープンリーディングフレーム) に由来するタンパク質の発現を抑制します 16。遺伝学および生物情報学の研究では、すべてのヒトタンパク質コード遺伝子の約 60% に uAUG17 が含まれていると推定されています。

今回、我々は、下流AUG（dAUG）の上流に位置するTREM2の5'-UTRにおけるuAUGの役割を報告する。興味深いことに、uAUG は霊長類では保存されているが、マウスでは保存されていないことが判明しました。ヒト TREM2 の 5'-UTR は、uAUG 依存的に dAUG から翻訳された従来の TREM2 (dTREM2 と呼ばれる) の発現を抑制することが判明しました。さらに、uAUG に由来する TREM2 アイソフォームを検出しました。私たちの研究は、TREM2 翻訳における 5'-UTR の種依存的な役割を明らかにしました。

配列比較により、ヒトを含むほとんどの霊長類種においてTREM2の5'-UTRのdAUGの90塩基上流に位置するuAUGの存在が明らかになったが、マウスなどの他の哺乳類には存在しなかった（図1a、補足図1a）。 1)。以下、簡単のために、dAUG の上流の 90 塩基領域を 5'-UTR と呼びます。リボソームプロファイリングデータセット18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38は、リボソームが最初の半分を認識することを示唆しましたヒト TREM2 の 5'-UTR の領域ではありますが、マウス Trem2 の対応する領域ではありません (補足図 2a、補足表 1)。 ribo-seqデータセット39を使用して、リボソームによるdAUGの使用と比較したuAUGの相対的な使用を調べたところ、リボソームによるuAUGの認識はdAUGの認識の約30％であることがわかりました（補足図2b）。細胞型は異なりましたが、マウスミクログリア40の同様の分析により、リボソームに結合したTrem2 5'-UTRのより低い割合（〜5％）が示唆されました（補足図2b）。したがって、我々は、uAUG が dTREM2 の翻訳に影響を与えるという仮説を立てました。我々は、異なる種のdAUGの上流の90塩基長の配列をヒトTREM2のコード配列（CDS）に融合した発現ベクターを調製した（図1b）。ヒトTREM2の5'-UTRは、TREM2の5'-UTRを欠く構築物と比較して、dTREM2の発現を有意に減少させた（図1c、d）。対照的に、マウス5'-UTRがこの遺伝子に融合された場合、dTREM2のそのような減少は観察されませんでした（図1c、d）。一方、チンパンジーとマーモセットの 5'-UTR は中間の効果を示しました。特に、霊長類の5'-UTRがこの遺伝子に融合された場合、dTREM2のバンドよりも大きなタンパク質バンドが検出されました（図1c、uTREM2と呼ばれます）。 uAUG からの翻訳は、dTREM2 の N 末端に追加された 30 アミノ酸残基の延長を持つ TREM2 アイソフォームを生成すると予測されます。これらのデータは、uAUG が dTREM2 の発現の抑制と uTREM2 の産生という 2 つの役割を果たすことを示唆しています。

下流AUG(dAUG)の上流90塩基のRNA配列比較。 uAUG と dAUG は、それぞれ緑色と灰色で強調表示されます。塩基置換はマゼンタでマークされています。 b 各種のdAUGの上流の90塩基配列と融合したヒトTREM2 CDSのキメラ構築物の概略図。 c 各キメラ構築物をトランスフェクトしたHEK293細胞を使用したウェスタンブロッティングの結果。赤い矢印は、uTREM2 のタンパク質バンドを示します。 d cにおけるTREM2タンパク質発現の定量分析。 Tukey のテストの結果が表示されます。エラーバーは平均±SD (n = 4) を表します。

uAUGの役割をさらに解明するために、HEK293ベースのFlp-Inシステムを使用して同質遺伝子細胞株を確立し、uAUGおよび/またはdAUGが変異した5'-UTRを含む全長ヒトTREM2ミニ遺伝子を安定して発現させました（図2a)。全細胞溶解物のウェスタンブロット分析では、5'-UTR-none由来のものと比較して、5'-UTR-WT細胞株由来のdTREM2の減少が示されました（図2b、c）。対照的に、5'-UTR-Muに由来するdTREM2の発現レベルは、5'-UTR-noneに由来するものと同等であった（図2b、c）。 5'-UTR-Md および 5'-UTR-Mud 細胞株では TREM2 タンパク質のバンドは観察されませんでした (図 2b)。したがって、dTREM2 タンパク質の発現レベルは uAUG 依存的に制御されているのに対し、5'-UTR-WT、5'-UTR-Md、および 5'-UTR-Mud に由来する TREM2 mRNA は比較して減少を示さなかった。 5'-UTR-noneからのレベルまで（図2d）。したがって、uAUG は翻訳レベルでの 5'-UTR による dTREM2 の抑制に不可欠です。

a 5'-UTR (非翻訳領域) を含むまたは含まない一連の fl-TREM2 ミニ遺伝子構築物の概略図。変異した開始コドンは赤色で示されます。これらのミニ遺伝子を安定して発現する HEK293 細胞は、Flp-In システムを使用して樹立されました。 b 各安定細胞株からの全細胞溶解物を SDS-PAGE で分離し、抗 TREM2 抗体でプローブしました。 c ウェスタンブロット結果の定量化。データは平均値 ± SD (n = 3、Tukey の検定) を表します。 d 各細胞株の TREM2 mRNA レベルを ACTB に対して正規化しました。エラーバーは平均値 ± SD (n = 3、Tukey の検定) を示します。 5'-UTR-none 細胞と 5'-UTR-WT 細胞の間に有意差は検出されませんでした。

図2bに示すように、uTREM2は5'-UTR-WT細胞および5'-UTR-Md細胞の全細胞溶解物中でほとんど検出できませんでした。次に、uTREM2 発現を検出するための最適な条件を調査しました。細胞溶解に 0.1% Triton-X-100 を使用し、免疫ブロッティングに TREM2 の C 末端に対する抗体を使用すると、5'-UTR-WT 細胞における uTREM2 に対応するタンパク質バンドの検出が容易になりました (赤い矢印、補足図) 3）。さらに、膜結合タンパク質画分を使用した場合、uTREM2が明確に検出されました（図3a）。 THP-1細胞は、これらの細胞がホルボールミリステート酢酸（PMA）で処理された場合にのみ、内在性uTREM2のタンパク質バンドを生成しました（補足図3）。 uTREM2バンドは5'-UTR-WTの膜結合タンパク質画分で検出されましたが、他の細胞では検出されませんでした（図3a）。

a 安定した細胞株の膜結合タンパク質画分をウェスタンブロット分析に供しました。赤い矢印は、uTREM2 のタンパク質バンドを示します。 APPをローディングコントロールとして使用しました。 b 免疫沈降および PNGase F 処理のスキーム。 c 示された細胞における抗 TREM2 抗体を使用した免疫沈降。赤い矢印は uTREM2 を示します。 d 5'-UTR (非翻訳領域) - なし、5'-UTR-WT、5'-UTR-Mu、および 5'-UTR-Md 細胞を免疫沈降した後、PNGase F で脱グリコシル化しました。 e THP で発現した TREM2 -1 細胞を免疫沈降させた後、PNGase F で処理しました。赤と青の矢印は、それぞれ uTREM2 と脱グリコシル化 uTREM2 のタンパク質バンドを示します (d、e)。

uTREM2の完全性を調べるために、5'-UTR-none、5'-UTR-WT、およびTHP-1細胞をdTREM2の外部ドメインに対する抗体で免疫沈降し、そのC末端に対する別の抗体でプローブしました（図3b））。 5'-UTR-WT細胞とTHP-1細胞の両方で、免疫沈降画分にuTREM2のタンパク質バンドが生じました（赤い矢印、図3c）。これは、uTREM2 が外部ドメインおよび C 末端配列を dTREM2 と共有していることも示しています。 uTREM2 に特定の N 末端ペプチドが含まれているかどうかを確認するために、5'-UTR 細胞からの uTREM2 のタンパク質バンドを免疫沈降後の液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 分析に供しました。その結果、uTREM2の固有のN末端に対応するペプチドMPDPLFSAVQGKを検出し（補足図4）、uAUGからの翻訳がuTREM2タンパク質の産生につながるという仮説を裏付けました。

TREM2 は翻訳後修飾としてグリコシル化を受けます 41。 uTREM2がグリコシル化されていることを確認するために、安定な細胞株に由来する免疫沈降生成物をPNGase Fで脱グリコシル化しました（図3b）。 PNGase Fの非存在下では、5'-UTR-WT細胞と5'-UTR-Md細胞の両方からの免疫沈降物は、uTREM2のタンパク質バンドを示しました（赤い矢印、図3d）。したがって、uTREM2は5'-UTR-Md細胞で発現されており、以前の実験でuTREM2が検出されなかったのはuTREM2のレベルが低かったためである可能性があります。 PNGase F処理後、5'-UTR-noneと5'-UTR-Muの両方が同様のパターンを示しました（図3d）。特に、5'-UTR-WT 細胞と 5'-UTR-Md 細胞では独特のタンパク質バンドが検出されましたが、これは 5'-UTR-none 細胞と 5'-UTR-Mu 細胞には存在せず、タンパク質に由来するものであるはずです。 uAUG (図3d、青い矢印で示す)は、uTREM2がグリコシル化を受けていることを意味します(図3d)。さらに、THP-1細胞は、5'-UTR-WTのタンパク質バンドパターンと同様のタンパク質バンドパターンを示しました（図3e）。これらの結果は、uTREM2 がグリコシル化されていることを示唆しました。

uTREM2がuAUGから翻訳されることを検証するために、5'-UTRに終止コドンを有する一連のfl-TREM2変異体ミニ遺伝子を調製しました（図4a）。 uAUGはuTREM2の最初のコドンであるため、uAUGからの6番目および23番目のコドンを含む置換は、それぞれF6XおよびC23Xと表されました。 uTREM2のタンパク質バンドは、5'-UTR-WT-F6Xミニ遺伝子と5'-UTR-WT-C23Xミニ遺伝子の両方で消失しました（赤い矢印、図4b）。同時に、dTREM2 の発現レベルがこれらの構築物によって部分的に回復したことは、TREM2 翻訳の抑制制御には uAUG から dAUG への連続的な翻訳が必要であることを示唆しています。 5'-UTR-Mu-F6Xおよび5'-UTR-WT-C23Xミニ遺伝子に由来するdTREM2タンパク質のレベルは、5'-UTR-Muミニ遺伝子に由来するものと同等であった（図4b）。さらに、uTREM2 と dTREM2 の両方のタンパク質バンドが 5'-UTR-Md ミニ遺伝子で検出されました。しかし、5'-UTR-Md-F6Xおよび5'-UTR-Md-C23Xミニ遺伝子ではタンパク質バンドは検出されませんでした（図4b）。これは、両方のバンドが 5'-UTR-Md ミニ遺伝子の uAUG によって開始された翻訳に由来することを強く示しています。

a 青色の線は、uAUG と下流 AUG (dAUG) の間に導入された終止コドンを表します。 F6X および C23X は、TREM2 の 5'-UTR (非翻訳領域) に導入された終止コドンを表します。 b これらのミニ遺伝子でトランスフェクトされた HEK293 細胞の膜結合画分をウェスタンブロッティングによって分析しました。 APPをローディングコントロールとして使用しました。赤い矢印は uTREM2 を示します。 c フレームシフト変異体の概略図。ミニ遺伝子のフレームシフトは、5'-UTR の中央への単一ヌクレオチドの挿入によって誘発されました。 d フレームシフトミニ遺伝子をトランスフェクトしたHEK293細胞の膜画分を、抗TREM2抗体を使用したウェスタンブロット分析に供しました。

また、一塩基挿入によりフレームシフトが導入された5'-UTRを有する全長ミニ遺伝子も調製した（図4c、FSと呼ぶ）。 uTREM2の発現も、5'-UTR-WT-FSミニ遺伝子によって破壊されました（図4d）。注目すべきことに、5'-UTR-WT-FS由来のdTREM2の発現レベルは5'-UTR-WTからの発現レベルと同等であり（図4d）、フレームシフト変異がdTREM2発現を増加させなかったことを示しています。これは、点突然変異（F6XまたはC23X）を導入することによって5'-UTR-WTのdTREM2が増加した上記の観察（図4b）とは対照的でした。これらの観察は、uAUG から dAUG を通過する連続翻訳が dTREM2 の抑制に寄与する可能性があるという事実と一致しています。 uTREM2とdTREM2の両方のタンパク質バンドは、5'-UTR-Md-FSミニ遺伝子によって無効になりました（図4d）。図4bに示す観察と併せて、これらの結果は、uTREM2がシグナルペプチドで部分的に消化を受けてdTREM2タンパク質を生成する可能性を高めます。これらの変異体間でTREM2の細胞内局在に違いはありませんでした（補足図5）。

次に、細胞ストレスに対するTREM2発現の応答を比較することにより、細胞生理学におけるTREM2の5'-UTRの重要性を調査しました（図5a、補足図6a）。この研究でテストされた細胞ストレス条件は次のとおりです。(i) アミノ酸飢餓。 (ii) バフィロマイシン A1 (BafA1)、液胞 H + -ATPase 阻害剤。 (iii) プロテアソーム阻害剤、MG132。 (iv) ポリイノシン酸ポリシチジル酸 (polyI:C)、二本鎖 RNA (dsRNA) の合成類似体。 (v) リポ多糖類 (LPS)、炎症のメディエーター。 5'-UTR-none細胞由来のdTREM2の発現レベルは、調べた条件下では変化しなかった（図5b）。興味深いことに、dTREM2よりわずかに小さいバンドがMG132処理した5 '-UTR-WT細胞に特異的に現れ（図5a）、プロテアソームによって完全に分解された5 '-UTR由来のTREM2タンパク質の存在を示唆しています。さらに、5'-UTR-WT細胞におけるdTREM2の発現レベルは、アミノ酸飢餓とポリI:C処理によって大幅に減少しました（図5a、c）。 BafA1およびLPS処理は、TREM2の発現レベルを変化させなかった（図5a、c）。しかし、アミノ酸飢餓とBafA1を同時に処理すると、5 '-UTR-WTのdTREM2の発現レベルが減少し（図5d）、アミノ酸飢餓によるdTREM2の減少がオートファジーによる分解の促進によるものではないことが示されました。 5 '-UTR-Mu細胞のdTREM2の発現レベルはアミノ酸飢餓によって変化しませんでしたが、5 '-UTR-Md細胞の発現レベルは減少しました（図5e）。これは、uAUGが両方のuTREM2の下方制御に必須であることを示していますdTREM2はアミノ酸飢餓によって媒介されます。 THP-1細胞の内因性dTREM2タンパク質は、アミノ酸飢餓時に同様の下方制御を示しました（補足図6b）。最後に、免疫蛍光法により TREM2 の細胞内局在を解析しました。 5'-UTR-noneおよび5'-UTR-Mu細胞株のTREM2シグナルは得られましたが、5'-UTR-WTおよび5'-UTR-Md細胞のTREM2シグナルはほとんど検出できませんでした（補足図7）。。したがって、我々はTREM2ミニ遺伝子を一過的に発現させ、TREM2の局在を観察しました。 5'-UTR-Mdをトランスフェクトした細胞ではTREM2発現はまだ低かったが、局在化のパターンは4つの構築物すべてで同様であり、異なる処理によって誘発される変化はほとんどありませんでした（補足図8）。

a 5'-UTR-none および WT 細胞株は細胞ストレスにさらされました。膜結合タンパク質の画分を、示された抗体を使用してウェスタンブロッティングに供した。赤い矢印は uTREM2 (上流の AUG から始まる TREM2 タンパク質アイソフォーム) を示します。 b、c ウェスタンブロットの結果に基づく、5'-UTR-none細胞（b）および5'-UTR-WT細胞（c）からの下流TREM2（dTREM2）の定量。未処理の対照との差異をダネット検定を使用して分析しました。エラーバーは平均±SD (n = 4) を表します。 d、e 安定した細胞株をバフィロマイシン A1 を含む飢餓培地で培養しました。全細胞溶解物を使用して、治療の効果を確認しました。

図5aに示すように、MG132処理により、5'-UTR-WT細胞ではdTREM2よりわずかに小さいバンドが得られましたが、5'-UTR-none細胞ではそうではありませんでした。このバンドは、MG132処理後の5'-UTR-Md細胞でも検出され（図6a）、これがuAUGに由来することを強く示唆しています。同様のバンドが、レベルは低いものの、MG132処理THP-1細胞の膜画分でも検出されました（図6b）。したがって、uAUG 由来産物の大部分はプロテアソームによって分解されると考えられます。

a 安定した細胞株の全細胞溶解物を MG132 で処理し、ウェスタンブロッティングで分析しました。ユビキチン (Ub) を MG132 治療の陽性対照として使用しました。赤と青の矢印は、それぞれ無傷の uTREM2 とプロテアソーム感受性型の uTREM2 のタンパク質バンドを示します。 b MG132 処理細胞の膜結合タンパク質画分のウェスタンブロット分析。 c uTREM2（uAUGから始まるTREM2タンパク質アイソフォーム）プロセシングの作業仮説。 uAUG に由来する uTREM2 の大部分はプロテアソームによって分解されます。残りの uTREM2 画分はグリコシル化され、切断されて dTREM2 (下流 AUG から始まる TREM2 タンパク質アイソフォーム) が生成されます。

この研究では、5'-UTR によって媒介されるヒト TREM2 翻訳に対する抑制的な調節効果を明らかにしました。また、アミノ酸飢餓に対する応答における 5'-UTR の関与も示しました。これらの特徴は一部の霊長類が共有する uAUG に依存しているため、今回の結果は TREM2 の種固有の特徴を強調しています。われわれは、uAUGを介したTREM2翻訳の調節が一部の霊長類では保存されているが、マウスでは保存されていないことを発見した（図1）。ヒトおよびマウスの TREM2 タンパク質は保存された機能を持っていると予想されていますが、これら 2 つのタンパク質は異なる制御機構を受けている可能性があります。たとえば、我々は最近、TREM2 がエクソン 342 の選択的スプライシングを受けることを報告しました。単核トランスクリプトームにより、AD43 の状況におけるヒトとマウスのミクログリア間の保存的応答と非保存的応答の両方が明らかになりました。したがって、我々の発見は、ミクログリアの種特異的な側面の理解に貢献する可能性があります。最近、AD のマウスモデルにおける Trem2 翻訳の上方制御が報告されています 44。 dTREM2翻訳を抑制するTREM2のuAUGはマウスTrem2には存在しないため、ADモデルマウスにおけるTrem2翻訳の活性化は、我々が説明したものとは異なるメカニズムを通じて起こる可能性がある。 AD患者におけるこれらの所見の重要性を判断するには、さらなる調査が必要です。我々の変異分析は、uAUGからdAUGへの連続翻訳がdTREM2発現の抑制に関与していることも示唆しており（図4）、これは翻訳開始をめぐるuAUGとdAUG間の競合と解釈できます。また、uAUG に応じて、dTREM2 レベルがアミノ酸飢餓とポリ (I:C) 処理によって低下することもわかり (図 5)、追加の決定基の関与が示唆されています 45。 dAUG の使用は、uAUG の存在下では、uAUG での翻訳開始、5'-UTR の二次構造、および 5'-UTR に結合するトランス作用因子によって媒介されるリボソームスキャニングの障害など、いくつかの要因によって制限される可能性があります。 -UTR46。 5'-UTR を介した抑制の正確なメカニズムが解明されれば、TREM2 の発現を調節する戦略が提供されるでしょう。

翻訳抑制に加えて、TREM2 5'-UTR は uTREM2 の発現にも関与しています。 uTREM2 の N 末端の 30 残基の延長により、シグナルペプチドの長さが増加します。予期せぬことに、5'-UTR-Md細胞では、uTREM2のタンパク質バンドとともにdTREM2のタンパク質バンドが観察されました（図4b）。 uAUGの下流に終止コドンが導入されると、両方のバンドが消失しました（図4b）。私たちは、uTREM2 の N 末端領域が dTREM2 のシグナルペプチドと同じ部位で切断され、その結果 dTREM2 が生成されると考えています。 uTREM2 の N 末端伸長により、シグナルペプチドが 18 アミノ酸から 48 アミノ酸に伸長されます。真核生物のシグナルペプチドの平均長は 22 残基 47 ですが、いくつかの遺伝子は 40 残基以上の長いシグナルペプチドを持っています 48。注目すべきことに、特にプロテアソーム阻害時に5 '-UTR-WTおよび5-UTR-Md細胞において、脱グリコシル化uTREM2を彷彿させるタンパク質バンドを検出しました（図6a、補足図9）。 uTREM2の主要な画分はプロテアソームによって急速に分解され、残りの画分はグリコシル化および切断されてdTREM2が生成されると推測します（図6c）。切断の遅延によりシグナルペプチドを保持するグリコシル化膜タンパク質 (US11) の別の例もあります 49。 uTREM2 の長いシグナルペプチドにより、プロテアソームによる uTREM2 の優先的な分解とシグナルペプチドの切断の遅延が生じた可能性があります。 uTREM2は、dTREM2産生の代替経路の中間体、またはuAUGを介したdTREM2抑制の副産物と見なすことができますが、その機能を決定するにはさらなる研究が必要です。

結論として、この研究はヒト TREM2 の翻訳における 5'-UTR の役割を明らかにしました。 uAUGを介したTREM2の調節機構はマウスでは保存されていないため、我々の研究は、TREM2関連疾患に関する新たな洞察を得るためにヒト由来細胞を使用した研究の重要性を強調している。翻訳レベルでの TREM2 の制御も重要ですが、トランスクリプトーム解析では見落とされる可能性があります。

この研究で使用したプライマーを補足表 2 に示します。すべての操作されたプラスミドは DNA 配列決定を受けました。

チンパンジー、マーモセット、およびマウスの 5'-UTR は、特異的プライマーを使用してゲノム DNA (それぞれ HSP-239、HSCj-11050、および 91062702 から取得) から増幅されました。 5'-UTRおよびヒトTREM2 CDS42の断片をPCRによって結合し、BamHIおよびXbaIで消化し、pcDNA3.1 Hygro (+) (Invitrogen)のBamHI-XbaI部位にクローニングした。

変異したuAUGおよび/またはdAUGを有するヒトTREM2の一連の5'-UTR配列は、以前に記載されているようにfl-TREM2ミニ遺伝子に融合されました51。 uAUG および/または dAUG の変異の有無にかかわらず 5'-UTR を取得するために、5'-UTR 融合 TREM2 CDS および fl-TREM2 ミニ遺伝子を PCR テンプレートとして使用して、5'-UTR から 5'-UTR までの領域を増幅しました。次に、PCR プライマーを使用して、ATG の GTG への置換を実行しました。これら 2 つのフラグメントを PCR 媒介増幅によって結合し、NheI および HindIII で消化し、fl-TREM2 ミニ遺伝子の NheI-HindIII 部位にクローン化しました。

F6XおよびC23X置換(残基数はuAUGから数えた)および単一ヌクレオチドのフレームシフト挿入は、対応する変異を有するプライマーを使用するPCRによって導入された。各断片をNheIおよびHindIIIで消化し、次いでTREM2の5'-UTRを含むfl-TREM2ミニ遺伝子のNheI-HindIII部位にクローニングした。プラスミド構築のためのPCRはKOD plus neo（TOYOBO）を用いて行った。

HEK293 細胞と HeLa 細胞は、10% ウシ胎児血清 (Sigma) およびペニシリン/ストレプトマイシン (Wako) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Thermo Fisher Scientific) で 37 °C、5% CO2 で維持しました。 Callithrix jacchus 由来の HSCj-110 細胞株 (JCRB1655)、ヒト由来の THP-1 株、Pan troglodytes 由来の HSP-239 細胞株 (JCRB1165) は JCRB50 から取得し、RPMI 1640 培地で維持しました ( GlutaMAX サプリメント、Thermo Fisher Scientific) に 10% ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンを 37 °C、5% CO2 で補充しました。 5'-UTR を持たない (5'-UTR-none) fl-TREM2 ミニ遺伝子を発現する安定な細胞株は以前に樹立されました 51。 fl-TREM2 ミニ遺伝子 (5'-UTR-WT、Mu、Md、および Mud) を安定して発現する細胞株は、以前の研究で説明したように Flp-In システムを使用して樹立されました 51。 fl-TREM2 ミニ遺伝子の組み込みは、フラグメント特異的プライマーを使用した PCR によって確認されました。

細胞を以下の条件下で処理した:アミノ酸を含まないピルビン酸ナトリウムを含むDMEM(高グルコース)(Wako)で4時間、100nMバフィロマイシン(Merck)で4時間、10μM MG132(Sigma)で12時間、2μg mLリポフェクタミン RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) を使用して −1 Poly(I:C) (Tocris Bioscience) を 24 時間、および 1 μg mL−1 LPS (Sigma) を 6 時間使用しました。プラスミド DNA トランスフェクションの日の前に、HEK293 細胞を 12 ウェルプレートに播種しました。通常、リポフェクタミン 2000 (Thermo Fisher Scientific) を使用して、0.5 μg のプラスミドを HEK293 細胞にトランスフェクトし、プラスミドトランスフェクションの 48 時間後に回収しました。 HeLa 細胞へのプラスミドのトランスフェクションには、リポフェクタミン 3000 (Thermo Fisher Scientific) を使用しました。

全 RNA の精製と定量分析は、以前に記載されているように実行されました 52。 ACTB を参照遺伝子として使用しました。

細胞分画とウェスタンブロッティングは以前の研究と同様に実行されました42。ルミノグラフ III (ATTO) を使用してブロッティング画像を取得しました。シグナル強度は、Fiji ソフトウェア (NIH) を使用して分析されました。図5に示すように、ブロッキングおよび抗体処理の前に、膜をポンソーS溶液で染色して総タンパク質を測定しました。ウェスタンブロッティングに使用される抗体は補足表3にリストされています。完全なブロット画像は補足図10に示されています。

タンパク質の同定は、以前に記載されたように 53 、若干の変更を加えて実行されました。簡単に説明すると、免疫沈降サンプルを SDS-PAGE で分離し、ゲルを Silver Stain MS Kit (Wako) で染色しました。タンパク質バンドをゲルから切り出し、脱色溶液で脱色しました。続いて、ゲルを２５ｍＭのジチオスレイトールで還元し、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１％（ｗ／ｖ）ヨードアセトアミドでアルキル化した。各ゲルを、消化バッファー [50 mM 重炭酸アンモニウム、0.01% (w/v) ProteaseMax Surfactant (Promega)、1.33 μg ml-1 トリプシン (Promega)、および 1.33 μg ml-1 リシルエンドペプチダーゼ (和光）］を行い、上清を残した。１５分間振盪した後、切り出したゲル部分から２．５％トリフルオロ酢酸を用いてペプチドを抽出した。消化後、得られたペプチドを脱塩し、StageTips (Thermo Fisher) を使用して濃縮した。移動相 A および B (0.1% ギ酸を含むアセトニトリル) を使用したグラジエントプログラムの順序は次のとおりです: 0% B (0 分) – 30% B (50 分) – 100% B (51 分) – 100% B ( 60分）。 LC-MS/MS データは Proteome Discoverer バージョン 2.4 (Thermo Fisher Scientific) で処理されました。 uTREM2 のアミノ酸配列を Uniprot データベースに追加しました (バージョン 04/2017、20,198 配列)。

免疫蛍光は、我々の以前の研究42に記載された方法に従って実行されました。簡単に説明すると、HeLa 細胞と HEK Flp-In 安定細胞株を 8 ウェルチャンバースライド (WATSON) で培養しました。細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ）で１０分間固定し、０．１％トリトンで５分間処理した。抗 TREM2 C 末端抗体と 3 時間インキュベートした後、細胞を Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) または Alexa Fluor 568 ロバ抗ウサギ IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific) で処理しました。）1時間。細胞は、DAPI (VECTOR LABORATORIES) を含む Vectashield 封入剤で封入されました。細胞画像は、共焦点顕微鏡 (LSM710; Carl Zeiss) を使用して取得しました。

免疫沈降のために、ヤギ抗ヒト TREM2 抗体 (R&D、AF1828) をプロテイン G 結合磁気ビーズ (Thermo Fisher Scientific) と混合しました。細胞を、1×プロテアーゼ阻害剤(Roche)を含むPBS中の0.1% Triton-Xで溶解し、続いて4℃で30分間回転させた。遠心分離 (16,000 x g、4 °C、10 分間) 後、上清をプロテイン G 結合磁気ビーズで 4 °C、2 時間事前に清澄し、抗 TREM2 抗体またはアイソタイプコントロールと結合した磁気ビーズで免疫沈降しました。 4 °C で一晩回転させます。ビーズをＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘで３回洗浄した。免疫沈降物を０．１ＭＧｌｙ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５、０．１５ｍＭＮａＣｌを含む）中でビーズから溶出した。ウサギ抗 TREM2 抗体 (CST、D8I4C) をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用しました。 TrueBlot anti-IgG HRP (ROCKLAND) を二次抗体として使用しました。

抗 TREM2 抗体による免疫沈降生成物を、製造業者の指示に従って PNGase F (NEB) を使用して脱グリコシル化しました。

統計解析にはEXCEL時計ソフト（エスミ株式会社）を使用した。すべてのグラフは、R ソフトウェア (バージョン 3.6.1、https://www.r-project.org/) を使用して作成されました。サンプルサイズは図の凡例で定義されています。測定値は、独立したトランスフェクションまたは細胞処理を表す異なる生物学的複製から取得されました。エラーバーは標準偏差 (SD) を表します。すべての統計検定は両側で行われ、図の説明に記載されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソースデータは補足データ 1 で入手できます。完全なブロットは補足情報に示されています。他のすべてのデータは、要求に応じて対応する著者から入手できます。

Wang, Y. et al. TREM2 脂質センシングは、アルツハイマー病モデルにおけるミクログリア反応を維持します。セル 160、1061–1071 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Y. et al. TREM2 は、ミクログリアの機能を仲介するベータアミロイドの受容体です。ニューロン 97、1023–1031.e1027 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フィリペッロ、F. et al. ミクログリアの自然免疫受容体 TREM2 は、シナプスの除去と正常な脳の接続に必要です。免疫 48、979–991.e978 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リュー、W.ら。 Trem2 はミクログリアの抗炎症反応を促進しますが、炎症促進性の条件下では抑制されます。ハム。モル。ジュネット。 29、3224–3248 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲレイロ、R. 他アルツハイマー病における TREM2 変異体。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 368、117–127 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジョンソン、T.ら。アルツハイマー病のリスクと関連する TREM2 の変異体。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 368、107–116 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

パロネバ、J.ら。受容体シグナル伝達複合体の異なるサブユニットをコードする 2 つの遺伝子の変異は、同一の疾患表現型をもたらします。午前。 J. ハム。ジュネット。 71、656–662 (2002)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garcia-Reitboeck、P. et al. TREM2 ミスセンス変異を有するヒト人工多能性幹細胞由来のミクログリア様細胞は、食作用に特異的な欠損を示します。 Cell Rep. 24、2300–2311 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、CYDら。 TREM2 遺伝子の用量の上昇は、アルツハイマー病モデルにおけるミクログリアの応答性を再プログラムし、病理学的表現型を改善します。ニューロン 97、1032–1048.e1035 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, S. et al. 抗ヒト TREM2 は、アルツハイマー病モデルにおいてミクログリアの増殖を誘導し、病状を軽減します。 J.Exp. 医学。 217、e20200785 (2020)。

ケレン・ショール、H. 他アルツハイマー病の発症の制限に関連するユニークなミクログリアのタイプ。セル 169、1276–1290.e1217 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カッツェネレンボーゲン、Y. et al. scRNA-Seq と細胞内タンパク質活性の組み合わせにより、がんにおける TREM2 の免疫抑制的役割が明らかになりました。セル 182、872–885.e819 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジェイティン、DA et al. 脂質関連マクロファージは、Trem2 依存的に代謝恒常性を制御します。セル 178、686–698.e614 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barrett, LW、Fletcher, S. & Wilton, SD 非翻訳遺伝子領域および他の非コード要素による真核生物の遺伝子発現の制御。細胞モル。生命科学。 69、3613–3634 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iacono, M.、Mignone, F. & Pesole, G. ヒトおよびげっ歯類の 5' 非翻訳 mRNA における uAUG および uORF。ジーン 349、97–105 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang, H.、Wang, Y. & Lu, J. 真核生物における上流 ORF の機能と進化。トレンド生化学。科学。 44、782–794 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、H.ら。真核生物における uORF のゲノム全体の分布と進化の決定因子。ナット。共通。 12、1076 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミシェル、AM et al. GWIPS-viz: ribo-seq ゲノムブラウザの開発。核酸研究所 42、D859–D864 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スー、Xら。インターフェロン-γは細胞代謝とmRNA翻訳を調節してマクロファージの活性化を強化します。ナット。イムノール。 16、838–849 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jang, C.、Lahens, NF、Hogenesch, JB & Sehgal, A. リボソームプロファイリングは、概日遺伝子発現における翻訳制御の重要な役割を明らかにします。ゲノム研究所 25、1836–1847 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, B.、Gogol, M.、Gaudenz, K. & Gerton, JL ロバーツ症候群における mTORC1 の L-ロイシン刺激による転写と翻訳の改善。 BMC ゲノミクス 17、25 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji, Z.、Song, R.、Huang, H.、Regev, A. & Struhl, K. RNA-タンパク質複合体のトランスクリプトームスケールの RNase フットプリンティング。ナット。バイオテクノロジー。 34、410–413 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gameiro, PA & Struhl, K. 栄養素の欠乏は、タンパク質合成の減少と連動した転写および翻訳の炎症反応を引き起こします。 Cell Rep. 24、1415–1424 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アイヒホルン、SW et al. mRNA の不安定化は、実質的な抑制が起こるまでに、哺乳動物の MicroRNA の主要な影響になります。モル。細胞。 56、104–115 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reid, DW、Xu, D.、Chen, P.、Yang, H. & Sun, L. トランスラトームとトランスクリプトームの統合分析により、マイクロRNAによって調節される褐色脂肪および白色脂肪における重要な翻訳制御が明らかになりました。科学。議員第7号、5681号（2017年）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cho、J.ら。記憶形成中の海馬における複数の抑制メカニズム。サイエンス 350、82–87 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホーンスタイン、N.ら。脳内の細胞型特異的翻訳のライゲーションフリーのリボソームプロファイリング。ゲノムバイオル。 17、149 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

フィールズ、AP 他。リボソームプロファイリングデータの回帰ベースの分析により、哺乳類翻訳の保存された複雑さが明らかになりました。モル。細胞。 60、816–827 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Castelo-Szekely, V.、Arpat, AB、Janich, P. & Gatfield, D. リズミカルで構成的な遺伝子発現における組織特異性への翻訳の寄与。ゲノムバイオル。 18、116 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Alvarez-Dominguez, JR、Zhang, X. & Hu, W. 赤血球発生の広範かつ動的な翻訳制御。ブラッド 129、619–629 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fradejas-Villar, N. et al. RNA 結合タンパク質 Secisbp2 は、UGA コドン再割り当てと RNA 崩壊を異なって調節します。核酸研究所 45、4094–4107 (2016)。

論文 PubMed Central Google Scholar

Janich, P.、Arpat, AB、Castelo-Szekely, V.、Lopes, M. & Gatfield, D. リボソームプロファイリングにより、上流のオープンリーディングフレームによるリズミカルな肝臓のトランスラトームと概日時計の制御が明らかになりました。ゲノム研究所 25、1848–1859 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アトガー、F.ら。概日リズムと摂食リズムは、マウス肝臓におけるリズミカルな mRNA の転写と翻訳に異なった影響を与えます。手順国立アカデミー。科学。 112、E6579–E6588 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, S. et al. 単一ヌクレオチド解像度での哺乳動物細胞の翻訳開始部位のグローバルマッピング。手順国立アカデミー。科学。 109、E2424–E2432 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

JA ハート、AD ロバートソンおよび CB バージ UPF1 結合と機能の全体的な解析により、ナンセンス媒介 mRNA 分解の拡大範囲が明らかになりました。ゲノム研究所 23、1636–1650 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Laguess, S. et al. 動的に折り畳まれていないタンパク質の応答は、皮質神経新生の制御に寄与します。開発者細胞。 35、553–567 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Guo, H.、Ingolia、NT、Weissman、JS & Bartel、DP 哺乳類のマイクロRNAは主に標的mRNAレベルを低下させるように作用します。自然 466、835–840。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カスタニェダ、J. 他パキテン性 piRNA と翻訳の減少が、Maelstrom 変異マウスにおける精子形成停止の根底にあります。 EMBO J. 33、1999–2019 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

アンサリ、SA et al. マクロファージのリボ-Seq および RNA-Seq データの統合分析により、グルココルチコイド受容体によって制御される炎症反応遺伝子が異なる制御クラスに定義されます。計算します。構造体。バイオテクノロジー。 J. 20, 5622–5638 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scheckel, C.、Imeri, M.、Schwarz, P. & Aguzzi, A. プリオン病中のリボソームプロファイリングでは、グリアにおける進行性の翻訳障害が明らかになりましたが、ニューロンでは明らかにされませんでした。イーライフ。 9、e62911 (2020)。

パーク、JSら。 TREM2 の疾患関連変異は、ゴルジ体における N 結合型オリゴ糖のプロセシングを変化させます。トラフィック 16、510–518 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yanaizu, M.、Washizu, C.、Nukina, N.、Satoh, JI & Kino, Y. CELF2 は TREM2 の種特異的選択的スプライシングを制御します。科学。議員 10、17995 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou、Y.ら。ヒトおよびマウスの単核トランスクリプトミクスにより、アルツハイマー病における TREM2 依存性および TREM2 非依存性の細胞応答が明らかになります。ナット。医学。 26、131–142 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eastman, G.、Sharlow, ER、Lazo, JS、Bloom, GS & Sotelo-Silveira, JR アルツハイマー病モデルマウスにおける病因のトランスクリプトームおよびトランスラトーム制御。 J.アルツハイマー病 86、365–386 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gretzmeier, C. et al. アミノ酸飢餓誘発マクロオートファジーによるタンパク質翻訳機構の分解。オートファジー 13、1064–1075 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jackson、RJ、Hellen、CUT、Pestova、TV 真核生物の翻訳開始のメカニズムとその制御の原理。ナット。モル牧師。セルバイオル。 11、113–127 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bendtsen, JD、Nielsen, H.、von Heijne, G. & Brunak, S. シグナルペプチドの予測の改善: SignalP 3.0。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 340、783–795 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

ヒス、JA et al. シングルパス内在性膜タンパク質の長いシグナルペプチドのドメイン構成により、複数の機能的能力が明らかになります。 PLoS One 3、e2767 (2008)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Rehm, A.、Stern, P.、Ploegh, HL & Tortorella, D. I 型膜タンパク質 HCMV US11 のシグナルペプチド切断は、その膜アンカーに依存しています。 EMBO J. 20、1573–1582 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

あかり、H. 他ヘルペスウイルスサイミリによる旧世界ザルTリンパ球のin vitro不死化：サル免疫不全ウイルス感染に対する感受性。ウイルス学 218、382–388 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yanaizu, M.、Sakai, K.、Tosaki, Y.、Kino, Y.、Satoh, JI 核内低分子 RNA を介したスプライシングの調節により、TREM2 変異とその転写後制御の治療戦略が明らかになりました。科学。議員番号 8、6937 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

佐藤、JI、木野、Y.、柳津、M.、石田、T.、斉藤、Y. ミクログリアは、アルツハイマー病と那須ハコラ病の脳でガンマインターフェロン誘導性リソソームチオール還元酵素を発現します。難治のレアディス。解像度 7、251–257 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

小池晋ほかメチルグリオキサール解毒欠損のマウスモデルの脳におけるカルボニルタンパク質の蓄積。酸化防止剤（バーゼル）。 10, 574 (2021)。

リファレンスをダウンロードする

監修と有益なコメントをいただいた佐藤淳一博士、技術支援をいただいた佐藤美奈子氏、五島葉月氏、小田由香氏に感謝いたします。本研究は、文部科学省科学研究費補助金 YK (16K09683, 19K07982, 16K07043, 20K07876) および MY (19J15024, 21K20700) の助成を受けて行われました。認知症医薬品資源開発センタープロジェクト（DRC）、文部科学省、日本（S1511016）。 MY は、JSPS 特別研究員のための科学研究費補助金 (助成金番号 JP19J15024) および日本薬学会からの永井記念研究奨学金によって支援されました。

明治薬科大学生命情報学・分子神経病理学教室〒204-8588 東京都清瀬市野塩2-522-1

Motoaki Yanaizu, Haruka Adachi & Yoshihiro Kino

明治薬科大学 RNA病態生物学教室〒204-8588 東京都清瀬市野塩2-522-1

Motoaki Yanaizu & Yoshihiro Kino

〒204-8588 東京都清瀬市野塩2-522-1 明治薬科大学生化学教室

Makoto Araki & Kenji Kontani

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MY と YK は実験を考案、設計し、原稿を書きました。 MYとHAが実験を行いました。 MA と KK は質量分析手順を実行しました。すべての著者が原稿を承認しました。

Correspondence to Yoshihiro Kino.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Dileep Kumar と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Gracjan Michlewski と Gene Chong。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

柳津正人、安達宏、荒木正他ヒト TREM2 の 5' 非翻訳領域の翻訳制御とタンパク質コード能力。 Commun Biol 6、616 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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受信日: 2022 年 9 月 8 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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