節足動物タンパク質に対する免疫は、マダニから脊椎動物宿主へのリケッチア病原体の伝播を阻害する

npj ワクチン第 8 巻、記事番号: 79 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

アナプラズマ・ファゴサイトフィルムによって引き起こされるヒトのアナプラズマ症は、米国で最も一般的なダニ媒介性疾患の 1 つです。 クロアシダニである Ixodes scapularis がこの細菌を媒介し、人間に感染させます。 この研究では、I. scapularis 膜結合有機アニオン輸送ポリペプチド 4056 (IsOATP4056) を抗ベクター ワクチンで標的化すると、マダニから脊椎動物宿主への A. phagocytophilum の伝播に影響を与えるという証拠を提供します。 Anaplasma phagocytophilum は、ダニおよびダニ細胞において IsOATP4056 の発現を誘導します。 IsOATP4056 の膜局在の増加は、A. ファゴサイトフィラムに感染したダニ細胞において明らかでした。 IsOATP4056 の最大の細胞外ループを標的とする低用量 (5 μg/ml) ではなく高用量 (10 μg/ml) の EL-6 抗体による処理では、ダニ細胞では細胞傷害効果が示されましたが、ヒト角化細胞細胞株 (HaCaT) では示されませんでした。 受動免疫、ダニ媒介感染、および 2 つの業者から注文したマウスとダニ細胞を用いて実施された in vitro 研究では、EL-6 抗体がダニからマウス宿主への A. phagocytophilum 感染を阻害するだけでなく、感染症の減少にも役立つことが示されました。節足動物のトール経路の活性化による、充血したダニ内およびダニ細胞内の細菌負荷。 さらに、EL-6 抗体で免疫したマウスを与えられたダニでは脱皮効率の低下が認められました。 総合すると、これらの結果は、A. ファゴサイトフィルムおよびおそらく医学的に重要な他のダニ媒介性病原体の伝播を標的とする抗ダニワクチン開発の良い候補を提供する。

ライムボレリア症、ヒトアナプラズマ症、エールリヒア症、ロッキー山紅斑熱、野兎病、ポワッサン脳炎、ダニ媒介性脳炎、キャサヌール森林病などのダニ媒介性疾患は、世界中で人間の健康に対する重要な脅威となっています1、2、3、4、5。 。 これらの病気を引き起こす病原体は、主にダニによって血粉を介して伝染します1、2、4、6、7。 気候変動や保有宿主やダニの入手可能性などの非生物的および生物的要因は、ダニおよびダニ媒介性疾患の地理的拡大/分布に寄与する可能性があります8、9、10。 ダニの侵入を阻止するための殺ダニ剤の使用などの従来の方法は、多くの場合あまり効果がありません11。 したがって、ワクチンの開発は、これらの病気を予防するためのより効果的で環境に優しいアプローチであると考えられます。

ダニ媒介性脳炎ワクチン (TICOVAC) の承認は、ワクチンがダニ媒介性疾患を標的とし予防するための理想的な戦略であるという証拠を提供します 12。 しかし、他のいくつかのダニ媒介性細菌性疾患を治療/予防するための認可されたワクチンはありません6、13、14。 単一のダニ種が複数のヒト病原体を媒介して伝染させる可能性があります 15、16、17。 したがって、マダニの侵入と病原体の伝播を直接標的とする革新的な戦略が非常に望まれています6,13,18。 いくつかの研究では、ダニ防御抗原に対するワクチン接種がダニの摂食および/または病原体の伝播を防ぐことが強調されています6、13、18、19、20、21、22、23、24。 したがって、新しい保存された防御抗原を特徴付ける研究は、複数のダニ種を標的とする万能抗ダニワクチンの開発にとって重要です。 抗ベクターワクチン候補は、同じベクターによって伝播される複数の病原体を標的にする可能性をもたらします。

偏性細胞内細菌であるアナプラズマ・ファゴサイトフィルムによって引き起こされるヒトのアナプラズマ症は、米国で最も一般的なベクター媒介疾患の 1 つです 25,26。 臨床症状には、発熱、倦怠感、頭痛、関節痛、血小板減少症、白血球減少症などがあります25。 この病原体は主にクロアシダニ Ixodes scapularis によって伝染します。 これらのマダニは、卵、幼虫、若虫、成虫の 4 つの段階で発育します10。 A. phagocytophilum による感染は、宿主のシグナル伝達を破壊し、細菌が哺乳動物と節足動物ベクターの両方で存続するのを助ける一連の現象を引き起こします 26、27、28、29、30、31、32、33、34。 私たちの研究室による以前の研究では、I. scapularis 有機アニオン輸送ポリペプチド (OATP) 4056 (IsOATP4056) が A. phagocytophilum 感染中に上方制御されることが示されました 35。 さらに、トリプトファン経路の代謝物であるキサンツレン酸 (XA) をダニおよびダニ細胞に外因的に添加すると、isoatp4056 の発現と細菌負荷の両方が増加しました 35。 isoatp4056 は、ダニの 9 つの OATP のうち、A. phagocytophilum 感染中に唾液腺で上方制御された唯一の OATP です 35。 RNAi を介した isoatp4056 のノックダウンと阻害剤による OATP の阻害は、ダニおよびダニ細胞における細菌の複製に影響を与えました 35。 また、ダニ媒介ランガットウイルス（LGTV）がダニのOATPを調節し、これらのタンパク質の阻害がダニ細胞のウイルス量に影響を与えることにも注目しました36。 さらに最近では、XA が病原体が活性酸素種から逃れるのを助けることができると報告しました 37。 追跡研究で、A. phagocytophilum が isoatp4056 mRNA を標的とする microRNA133 (miR-133) を下方制御することを報告しました 38。 マダニにおける miR-133 の過剰発現は、マダニから脊椎動物宿主への A. phagocytophilum の感染に影響を与え、この細菌感染における IsOATP4056 の重要性を示唆しています 38。 また、マダニから脊椎動物宿主への A. ファゴサイトフィルムの伝播中に isoatp4056 の発現が上方制御されていることにも注目しました。 全体として、これらの研究は、IsOATP4056 を標的とすることが、マダニから脊椎動物宿主への A. phagocytophilum の伝播を阻止するための理想的な戦略である可能性があるという強力な証拠を提供しています。

OATP は、いくつかの細胞外および細胞内ループを持つ膜貫通輸送タンパク質です 39、40、41、42。 これらのタンパク質は、さまざまなホルモン、陰イオン、シグナル伝達分子、毒素、成長因子の細胞内移動を助けます39、40、41、42、43。 バイオインフォマティクスによる予測に基づくと、IsOATP4056 の C 末端部分は細胞膜の外に伸びています 36 が、これは他のダニやヒトの OATP では観察されません。 この研究では、in vitro および in vivo 実験を行うために、細胞外ループ 2 (EL-2) および C 末端細胞外ループ 6 (EL-6) に対して生成された 2 つのアフィニティー精製ポリクローナル抗体を使用しました。 この研究は、IsOATP4056 の EL-6 に対する抗体の存在により、ダニ細胞と免疫マウスを与えられた感染ダニの両方における A. ファゴサイトフィルムの負担が大幅に減少することを示しています。 さらに、EL-6 抗体による受動免疫により、ダニからマウス宿主への細菌の伝播が減少することにも注目しました。 また、EL-6 抗体の存在がダニとダニ細胞の両方で TOLL 経路を活性化し、細菌量の減少に役立つことも示します。 この研究は、A.ファゴサイトフィルムおよびおそらく他の病原体のマダニから脊椎動物宿主への伝播を標的とする新しいダニ防御抗原のワクチン有効性に関する証拠を提供する。

我々の以前の研究では、ダニにおける A. phagocytophilum 感染時に isoapt4056 転写物が有意に上方制御されることを報告しました 35。 同様の観察がタンパク質レベルで明らかかどうかを分析するために、この研究では、IsOATP4056 細胞外ループ-2 (EL-2) および細胞外ループ-6 (EL-6) ペプチドに対して生じたアフィニティー精製ポリクローナル抗体を生成しました (図 1a)。 。 EL-6は、IsOATP4056に存在する6つの細胞外ループの中で最大の領域です（図1a）。 酵素免疫吸着法 (ELISA) では、対照で観察された結合と比較して、それぞれの IsOATP4056 ペプチドに対する EL-2 (図 1b) および EL-6 (図 1c) 抗体の結合が有意に (P < 0.05) 増加していることが示されました。スクランブルペプチド。 さらに、EL-2（図1d）およびEL-6（図1e）抗体とダニ全体またはダニ細胞溶解物を用いて実行されたELISAは、無給餌A.ファゴサイトフィラム感染におけるIsOATP4056の発現の有意な（P < 0.05）増加を示しました。非感染対照で記録されたレベルと比較した若虫ダニ（図1dおよびe）およびダニ細胞（補足図1aおよびb）。 さらに、脱グリコシル化ミックスの存在下 (+) または非存在下 (-) で EL2 または EL6 抗体を用いた免疫ブロット分析により、A. ファゴサイトフィラムに感染したダニ全体またはダニ細胞溶解物から生成されたサンプルにおいて、記載されたレベルと比較して 250 kDa を超える強いバンドが明らかになりました。両方の条件の非感染対照において（図1fおよびg）。 しかし、脱グリコシル化後のEL6抗体ではなくEL2抗体によるイムノブロッティングでは、非感染細胞で観察されたレベルと比較して、A.ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞から生成したサンプルでは〜250 kDaおよび〜100 kDaの強いバンドも明らかであることに注目しました。コントロール（図1fおよびg）。 A. ファゴサイトフィラムに感染した A. ファゴサイトフィラムから調製したライセートでは、>250 kDa のバンド (すべての条件で) および ~250 kDa および ~100 kDa のバンド (脱グリコシル化条件後の EL-2 抗体によるプローブ) のレベルが 2 ～ 3 倍増加していることが明らかでした。非感染コントロールから調製した溶解物で記録されたレベルと比較した場合のダニ細胞（図1fおよびg）。 さらに、EL-6 抗体を用いて行われた免疫蛍光分析では、非感染コントロールで観察された染色と比較して、A. ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞で IsOATP4056 染色の増加が示されました (図 2)。 さらに、非感染対照の細胞膜上で認められたレベルと比較して、IsOATP4056 レベルの上昇が、A. ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞の細胞膜上に局在していることが認められました（図 2）。 まとめると、これらの結果は、A. phagocytophilum がダニおよびダニ細胞において IsOATP4056 を上方制御し、ダニ細胞の原形質膜上でのこのタンパク質の局在を増強することを示しています。

a ダニ細胞原形質膜上の IsOATP4056 組織化の概略図が示されています。 細胞外ループは 1 ～ 6 の番号で示されます。 N 末端と C 末端は標識されています。 抗体は、EL-2 または EL-6 領域のエピトープに対して生成されました。 回路図は縮尺どおりに描かれていません。 EL-2 または EL-6 抗体でプローブされたスクランブルペプチド (b および c)、EL-2 ペプチド (b)、EL-6 ペプチド (c) を使用して実行された ELISA が示されています。 EL-2 (d) または EL-6 (e) 抗体でプローブした、給餌されていない未感染または A. ファゴサイトフィルム感染幼虫ダニから調製した全ダニ溶解物を用いて実施した ELISA を示します。 各丸/四角は、1 つの培養ウェルからの 1 つのダニまたはダニ細胞サンプルから生成されたデータを示します。 学生テストの p 値が表示されます。 エラーバーは、平均値からの +/- 標準誤差を示します。 脱グリコシル化ミックスの存在下 (+) または非存在下 (-) における、非感染または A. ファゴサイトフィラム感染ダニまたはダニ細胞における IsOATP4056 のレベルを示す、EL-2 (f) または EL-6 (g) 抗体を用いた免疫ブロット分析が示されています。 矢印は、IsOATP4056 のオリゴマー型 (>250 kDa) を示します。 ** は IsOATP4056 の二量体形態 (約 250 kDa) を示し、* は IsOATp4056 の単量体形態 (約 100 kDa) を示します。 Mはマーカーを示し、UIは未感染を示し、IはA.ファゴサイトフィラムに感染したダニまたはダニ細胞を示します。

EL-6 抗体を使用した非感染または A. ファゴサイトフィルム感染ダニ細胞における IsOATP4056 レベル (Alexa-594、赤) および核染色 (青、DAPI) を示す位相差または蛍光顕微鏡画像。 結合された画像は、IsOATP4056 と DAPI 染色の重ね合わせを示しています。 結合された画像に挿入すると、全体画像内の矢印で示されたセルの展開画像が表示されます。 スケールバーは 100 μm を示します。

我々の以前の研究では、RNAi を介した isoatp4056 発現のノックダウンにより、ダニとダニ細胞の両方における細菌負荷が減少することが示されました 35。 ここで、抗体を介した IsOATP4056 の遮断がダニ細胞の細菌負荷に対して同様の効果があるかどうかをテストしました（図 3 および補足図 2）。 A.ファゴサイトフィルムによる感染の1日前に、ダニ細胞を5μg/mlのEL-2（補足図2）またはEL-6（図3）抗体で処理しました。 感染後 24 時間で細菌量をモニタリングしました。 QRT-PCR分析により、コントロール抗体で処理したダニ細胞で認められた負荷と比較して、EL-6抗体でダニ細胞を処理すると、A.ファゴサイトフィルム負荷が大幅に減少することが示されました（図3a）。 ただし、EL-2抗体で処理したダニ細胞とコントロール抗体で処理したダニ細胞の間で細菌負荷に有意差は認められませんでした（補足図2）。 我々は最近、A. phagocytophilum がダニからの伝達中に、節足動物の自然免疫遺伝子の概日時計制御を調節することを示しました 44。 したがって、我々は、EL-6 抗体治療による細菌負荷の減少の観察がダニ免疫遺伝子の活性化に関連しているかどうかを推論しました。 QRT-PCR分析により、節足動物Toll経路遺伝子、myd88およびpelleが、対照抗体処理群で認められたレベルと比較して、EL6抗体処理A.ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞において有意に(P<0.05)上方制御されていることが明らかになった(図1)。 .3gとh）。 ただし、jak (図3b)、stat (図3c)、pgrp (図3d)、tak (図3e)、およびtoll (図3f) 遺伝子の発現にはEL-6間で明らかな差はありませんでした。抗体処理および対照抗体処理した A. ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞。 さらに、EL-2抗体処理またはコントロール抗体処理のA.ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞間で、試験した免疫遺伝子の発現に有意差（P>0.05）は明らかではありませんでした（補足図2b〜h）。 Toll 経路が EL6 抗体媒介細菌クリアランスに重要であるかどうかをさらに確認するために、A. phagocytophilum に感染したダニ細胞における myd88 発現をサイレンシングしました (図 3i)。 A.ファゴサイトフィラムに感染したダニ細胞におけるmyd88のRNAi媒介ノックダウンは、細菌負荷の有意な(P<0.05)増加をもたらした(図3j)。 しかし、myd88-dsRNAを含むA.ファゴサイトフィルム感染ダニ細胞をEL-6抗体で処理すると、そのレベルと比較してmyd88発現が有意に（P < 0.05）増加し（図3k）、細菌負荷が減少しました（図3l）。コントロール抗体で処理した細胞で認められます。 総合すると、これらの結果は、EL-6 抗体治療が節足動物の自然免疫経路の活性化を通じてダニ細胞の A. ファゴサイトフィルム感染を効率的に除去することを示しています。

細菌負荷を示す QRT-PCR 分析。p44 レベル (a)、jak (b)、stat (c)、pgrp (d)、tak1 (e)、toll (f)、myd88 (g) または pelle (h) によって分析）コントロールまたはEL-6抗体で処理したA.ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞における発現。 対照抗体およびEL-6抗体は5μg/mlの濃度で使用した。 モックまたはmyd88-dsRNAで処理したA.ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞におけるmyd88発現レベル(i)または細菌負荷(j)を示すQRT-PCR分析。 対照またはEL-6抗体で処理したmyd88-dsRNA含有A.ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞におけるmyd88発現(k)または細菌負荷(l)を示す。 アナプラズマ・ファゴサイトフィルム p44 レベルはダニのアクチン レベルに正規化され、ダニの自然免疫遺伝子の mRNA レベルはダニの 5.8 S rRNA レベルに正規化されました。 学生テストの p 値が表示されます。 エラーバーは平均値の +/- 標準誤差を示します。 各円は、ダニ細胞培養プレートの 1 つのウェルから収集されたサンプルから得られたデータを表します。

EL-2 または EL-6 抗体が細胞傷害効果を有するかどうかをさらに分析するために、ダニ細胞 (図 4) およびヒトケラチノサイト細胞株 (HaCaT 細胞) (図 5) を使用して、記載されているとおり 38 生/死細胞ベースのアッセイを実行しました。 ）。 ダニ (図 4) または HaCaT (図 5) 細胞を 10 μg/ml の EL-2 または EL-6 抗体で 24 時間処理し、生死染色および MTT アッセイのために処理しました。 対照抗体処理時に観察された細胞死と比較して、EL-2またはEL-6抗体で処理したダニ細胞では死の増加が観察されました（図4a）。 顕微鏡画像からの定量化により、EL-6およびEL-2抗体で処理したダニ細胞では、対照と比較して有意な数の死細胞が示されました（図4b）。 さらに、MTTアッセイでは、対照抗体で処理した細胞で観察された生存率と比較して、EL-2（図4c）またはEL-6（図4d）抗体で処理するとダニ細胞の生存率が大幅に低下したことが確認されました（図4）。 しかし、EL-2またはEL-6抗体によるHaCaT細胞の処理は、対照抗体処理で観察された細胞死と比較して細胞死の増加をもたらさなかった(図5a)。 顕微鏡画像からの定量化により、対照と比較して、EL-6抗体処理ダニ細胞とEL-2抗体処理ダニ細胞との間の死細胞数に差がないことが示された（図5b）。 MTTアッセイにより、EL-2（図5c）またはEL-6（図5d）抗体による処理がHaCaT細胞の細胞死をもたらさないことがさらに確認された。 5μg/mlのEL-2またはEL-6抗体によるダニ細胞の処理では、重大な細胞死は生じませんでした（補足図3および4）。 これらの結果は、EL-2 および EL-6 抗体はダニ細胞に対してのみ細胞傷害性を持ち、ヒト細胞に対しては細胞傷害性を持たないこと、および細胞死に対するこれらの抗体の効果は用量依存性であることを示しています。

a 生きている (緑) または死んだ (赤) 非感染ダニ細胞を示す位相差または蛍光顕微鏡画像。 非感染ダニ細胞を、対照または10μg/ml濃度のEL-2またはEL-6抗体のいずれかで処理した。 処理から 24 時間後、細胞を生死染色アッセイ用に処理し、続いて蛍光顕微鏡を使用して画像化しました。 スケールバーは200μmを示します。 b 5 つの画像からの死細胞 (赤) の定量化が表示されます。 MTT アッセイは、10 μg/ml 濃度のコントロール (c および d)、または EL-2 (c) または EL-6 (d) 抗体で処理したときのダニ細胞の生存率を示します。 縦軸は、570 nmで測定した吸光度から690 nmで測定した吸光度を差し引いた吸光度の値を示す。 エラーバーは平均値の +/- 標準誤差を示します。 学生テストの p 値が表示されます。

a 生きている (緑) または死んだ (赤) 非感染 HaCaT 細胞を示す位相差または蛍光顕微鏡画像。 未感染の HaCaT 細胞を、コントロールまたは 10 μg/ml 濃度の EL-2 または EL-6 抗体のいずれかで処理しました。 処理後 24 時間後、細胞を生死染色アッセイ用に処理し、続いて蛍光顕微鏡を使用して画像化しました。 スケールバーは200μmを示します。 b 5 つの画像からの死細胞 (赤) の定量化が表示されます。 MTT アッセイは、10 μg/ml 濃度のコントロール (c および d)、または EL-2 (c) または EL-6 (d) 抗体で処理した際の HaCaT 細胞の生存率を示します。 エラーバーは平均値の +/- 標準誤差を示します。 学生テストの p 値が表示されます。 縦軸は、570 nmで測定した吸光度から690 nmで測定した吸光度を差し引いた吸光度の値を示す。

EL-6抗体で処理するとダニ細胞の細菌量が大幅に減少するという観察（図3）をきっかけに、マウス宿主の受動免疫が吸血中のダニから脊椎動物宿主へのA.ファゴサイトフィルムの感染に影響を与えるかどうかを調査するようになりました。 2 つの異なる販売業者 (それぞれ Envigo および Charles River Laboratories) から入手した、年齢と背景が一致した C3H マウス (C3H/HeNHsd および C3H/HeN) に、対照抗体または EL-2 抗体または EL-6 抗体を 15 μg/μg で注射しました。マウス（図6および補足図5）。 免疫化の24時間後、A.ファゴサイトフィラムに感染した非給餌若虫(ダニ10匹/マウス)をこれらの免疫化マウスに給餌した(図6a)。 細菌量を、ダニ配置後7日目のマウスの血液および脾臓組織、および充血した十分なダニで分析しました（図6および補足図5）。 QRT-PCR分析により、EL-6抗体免疫マウスから分離されたC3H/HeNHsd（Envigo）マウスの血液（図6b）および脾臓組織（図6c）において、A.ファゴサイトフィルム負荷量が有意に（P<0.05）減少していることが明らかになりました。対照ＩｇＧで免疫化したマウスから単離したマウスの血液（図６ｂ）および脾臓組織（図６ｃ）で認められた細菌量と比較した。 同様の観察は、EL-6抗体で免疫したC3H/HeN(Charles River Laboratories)マウスを用いて実施した免疫研究でも明らかであった(図6dおよびe)。 EL-2抗体を用いて行われた免疫研究では、EL-2抗体で免疫したC3H / HeNHsdマウスと対照IgG抗体で免疫したC3H / HeNHsdマウスの間で細菌負荷に有意差は示されませんでした（補足図5）。 これらの結果は、EL-6 抗体による免疫化がダニからネズミ宿主への A. ファゴサイトフィルムの伝播を効果的に減少させることを示しています。

a 予防接種研究の計画を示す概略図。 0日目に、マウスを対照、EL-2またはEL-6抗体(15μg/マウス)で受動的免疫化した。 1日目に、A.ファゴサイトフィルムに感染したダニを免疫化マウスに与えた。 4～7日目に、満腹状態で満腹した若虫を集めた。 免疫後 8 日目にすべてのマウスを安楽死させ、血液/脾臓組織を採取しました。 対照またはEL-6免疫化マウスの血液(bおよびd)または脾臓組織(cおよびe)におけるA.ファゴサイトフィルム負荷を示すQRT-PCR分析。 免疫化は、Envigo (b および c) または Charles River Laboratories (d および e) から入手したマウスで実行されました。 細菌量はマウスのアクチンレベルに対して正規化されました。 各円は 1 匹のマウスサンプルから得られたデータを表します。 エラーバーは平均値の +/- 標準誤差を示します。 学生テストの p 値が表示されます。

ダニ自体内のA.ファゴサイトフィルム負荷に対するマウス宿主の受動免疫の影響を決定するために、充血した豊富なダニからのサンプルをPCRおよびELISA用に処理しました（図7および補足図6）。 ELISAは、A.ファゴサイトフィラムに感染した若虫が血粉とともにEL-6（図7a）およびEL-2（補足図6a）抗体を体内に摂取したことを示した。 QRT-PCR分析により、EL-6抗体で免疫したマウスを与えたダニではA.ファゴサイトフィルム負荷が、対照抗体で免疫したマウスを与えたダニで認められた負荷と比較して有意に（P<0.05）減少したことが示されました（図7b）。 ただし、EL-2抗体を与えられたダニと対照抗体で免疫化されたマウスとの間で細菌負荷の有意差は明らかではありませんでした（補足図6b）。 EL-6抗体または対照抗体で免疫したマウスを与えられたダニでは、jak、stat、pgrp、tak1、およびpelleの発現に有意な差は見られなかった(図7)。 しかし、節足動物のトール転写産物は、対照抗体免疫動物を与えたダニで認められたレベルと比較して、EL-6抗体免疫マウスを与えたダニでは有意に上方制御されていた（図7g）。 さらに、ダニ細胞で認められた観察と同様に、節足動物のmyd88転写産物は、対照抗体免疫動物を与えたダニで認められたレベルと比較して、EL-6抗体免疫マウスを与えたダニでは有意に上方制御されていた（図7h）。 さらに、EL-2抗体で免疫したマウスを与えたダニでは、分析した節足動物免疫遺伝子の発現のいずれも、対照抗体で免疫したマウスを与えたダニで認められたレベルと比較して、有意な差は観察されませんでした（補足図6）。 ）。 まとめると、これらの結果は、EL-6 抗体が Myd88 を介した節足動物免疫経路の活性化により、充血したダニの細菌量を減少させることを示しています。

ダニの体内にEL-6抗体が存在することを示すELISA。 A. phagocytophilum における細菌負荷 (b) および jak (c)、stat (d)、pgrp (e)、tak (f)、toll (g)、myd88 (h) または pelle (i) の発現を示す QRT-PCR 分析。 -感染したダニに対照マウスまたはEL-6抗体で免疫したマウスを与えた。 マウスを、15μg/マウスの濃度の対照抗体またはEL-6抗体で免疫した。 A. phagocytophilum p44 レベルはダニのアクチン レベルに正規化され、ダニの自然免疫遺伝子の mRNA レベルはダニの 5.8 S rRNA レベルに正規化されました。 学生テストの p 値が表示されます。 エラーバーは平均値の +/- 標準誤差を示します。 各円は、1 つのティックから生成されたサンプルから取得されたデータを表します。

EL-2 または EL-6 抗体で処理するとダニ細胞死が観察されたため、これらの抗体がダニの脱皮に影響を与えるかどうかを調査するようになりました。 年齢およびバックグラウンドが一致したC3H/HeNHsd (Envigo)に、対照抗体またはEL-2抗体またはEL-6抗体を30μg/マウスで注射した(図8a)。 免疫化の24時間後、これらの免疫化マウスにナイーブ非給餌幼虫(15ダニ/マウス)を給餌した(図8a)。 ダニを配置してから 3 ～ 5 日後に、充満した充血ダニを収集しました。 対照抗体、EL-2またはEL-6抗体で免疫したマウスから、それぞれ合計25匹、22匹、および11匹の給餌幼虫を収集した。 これらの餌を与えられた若虫ダニは、脱皮のために環境チャンバーに収容されました（図8a）。 餌を与えられた若虫ダニは、30日間の孵化後に成虫段階に脱皮し始めました。 我々は、対照抗体で免疫したマウスを与えられた若虫ダニの92％が成虫に脱皮したことに注目した（図8b）。 一方、EL-2またはEL-6抗体免疫マウスをそれぞれ給餌した若虫ダニの81％または63％が成虫に脱皮した（図8b）。 まとめると、これらの結果は、EL-6 抗体による治療が in vitro でダニ細胞死を引き起こすだけでなく、ダニの脱皮にも影響を与えることを示しています。

a 予防接種研究の計画を示す概略図。 0日目に、マウスを対照、EL-2またはEL-6抗体(30μg/マウス)で受動的免疫化した。 1日目に、未感染のダニを免疫化マウスに与えた。 4～7日目に、満腹状態のニンフを集めた。 免疫後 8 日目に、すべてのマウスを安楽死させました。 満腹状態の若虫を環境チャンバー内で培養し、ダニが脱皮できるようにしました。 b 対照またはEL-2またはEL-6抗体で免疫したマウスを与えられたダニの脱皮効率のパーセンテージを示すヒストグラム。 この研究で分析された総数に対する脱皮したダニの数が各バーの上部に示されています。

節足動物防御抗原を標的とする抗ダニワクチンの開発は、ワクチン学の分野における革新的なアプローチです6、18、22、23、45。 それは、同じダニによって媒介される複数の病原体を標的にすることを提案します6、18、22、23、45。 抗ベクターワクチン戦略は、マダニへの病原体の獲得、マダニの定着、またはマダニからの病原体の伝播を阻止するように設計されています6、18、22、23、45。 いくつかの研究では、ダニが分泌する細胞質タンパク質または膜タンパク質を標的とするワクチンの生成を試験または提案しています6、18、21、22、23、45。 この研究では、膜輸送体タンパク質であるダニ IsOATP4056 を標的とすることが、節足動物ベクターから脊椎動物宿主への A. ファゴサイトフィルムの伝播に影響を与えるという証拠を提供します。

ELISA、イムノブロッティングおよび免疫蛍光分析の結果は、非感染対照で観察されたレベルと比較して、A.ファゴサイトフィラムに感染したダニおよびダニ細胞におけるIsOATP4056レベルの増加を示しており、我々の研究室から以前に発表された遺伝子発現データと一致しています35、37、38。 、46。 一次アミノ酸配列に基づいて、タンパク質の予想分子量は約 100 kDa です。 IsOATP4056 には、グリコシル化部位を含むいくつかの翻訳後修飾残基があります 36。 脱グリコシル化混合物の非存在下で EL-2 および EL-6 抗体を用いたイムノブロッティングでは、すべての A. phaghocytophilum 感染ダニおよびダニ細胞サンプルで >250 kDa の強いバンドが示されました。 脱グリコシル化後であっても、感染したダニ細胞サンプル > 250 kDa において増加した強いバンド (EL2 抗体で検出) が存在することは、IsOATP4056 がオリゴマー化された形態または他の翻訳後修飾された形態で存在する可能性があることを示しています。 ～ 250 kDa のバンドの検出は IsOATp4056 の二量体化を示し、～ 100 kDa のバンドは単量体形態を示します。 EL-2 と EL-6 は、IsOATP4056 タンパク質の異なる細胞外ループです。 脱グリコシル化は、オリゴマー化形態または他の翻訳後修飾形態の IsOATP4056 への EL-6 抗体の結合に影響を与えませんでした (バンド > 250 kDa)。 IsOATP4056 上の EL-2 抗体と EL-6 抗体の結合親和性は異なる可能性があると考えられます。 ここで、EL-6 抗体は IsOATP4056 のオリゴマー型のエピトープを容易に認識でき、EL-2 抗体はオリゴマー/その他の翻訳後修飾型をさらに認識できますが、脱グリコシル化/二量体/単量体型の IsOATP4056 も認識できます。 ダニ IsOATP4056 の複数の形態の観察は、二量体/ホモまたはヘテロオリゴマーを形成する哺乳動物の OATP の観察と一致しています 47,48。 さらに、EL-2 抗体を用いたイムノブロット分析における複数のバンドの観察は、IsOATP4056 もタンパク質分解的に切断される可能性があることを示唆しています。

最近の研究で、我々は、Toll と JAK/STAT 経路の免疫遺伝子 (それぞれ pelle や jak など) の概日制御がマダニから脊椎動物宿主への A. phagocytophilum の伝播に重要であることを報告しました 44。 この研究では、EL-6 抗体の存在下でのダニおよびダニ細胞の細菌減少には、Toll 経路、特に Myd88 の活性化が重要であることに注目しました。 ダニまたはダニ細胞の治療にEL-2またはEL-6抗体のいずれかを使用した場合、EL-6抗体治療のみがToll/Myd88経路の活性化をもたらし、おそらく細菌量の減少につながったと考えられます。 myd88-dsRNAで処理したダニ細胞における細菌負荷の有意な増加とそれに続くEL-6抗体処理によるこれらの細胞内の細菌の減少の観察により、細菌排除におけるToll経路のEL-6媒介活性化がさらに確認された。 IsOATP4056 には 6 つのループがあり、EL-2 抗体は 2 番目のループのエピトープに結合し、EL-6 抗体は 6 番目のループのエピトープに結合します。 我々は、EL-6 抗体の 6 番目のループへの結合によりシグナル伝達の混乱が生じ、最終的にダニの Toll 経路の活性化が引き起こされたのではないかと考えています。 ただし、EL-6 抗体が IsOATP4056 に結合した後の Toll 経路活性化の詳細なメカニズムは解明される必要があります。 これに関連して、以前の研究で、LPS49 による治療時に TLR-4 依存的にマウス OATP-4 がダウンレギュレーションされることが報告されたことは興味深いことです。

10 μg/ml の EL-2 または EL-6 抗体で処理すると、ダニ細胞では細胞死が観察され、HaCaT 細胞では細胞死が観察されないことから、これらの抗体はダニ IsOATP4056 に特異的であることが示唆されます。 しかし、5 μg/ml で処理したダニ細胞では細胞死が観察されなかったため、この観察は抗体の用量に依存していました。 OATP はいくつかの分子の輸送に関与しています 39,40,41,42,43。 したがって、IsOATP4056 の細胞外ループをブロックすると、最終的に細胞死につながる可能性のある栄養素を含むさまざまな分子の輸送に影響を与える可能性があるという仮説を立てるのは驚くべきことではありません。 さらに、EL-6 抗体で免疫したマウスを与えたダニの脱皮が減少するという観察は、IsOATP4056 がダニ細胞の生存に重要であることをさらに裏付けています。

マダニは脊椎動物の宿主を食べると、血液粉中の宿主タンパク質を摂取します50。 したがって、EL-6 または EL-2 抗体で免疫したマウスを食べる間にマダニも抗体を摂取する可能性があるという仮説を立てるのは合理的です。 私たちの ELISA データは、マダニが血粉中の EL-6 抗体と EL-2 抗体の両方を実際に摂取することを明確に示しています。 EL-6 免疫マウスを与えたダニの細菌量の減少は、IsOATP4056 を標的とすることが、あるダニの発育段階から別の発育段階への A. ファゴサイトフィルムの胸腔内伝達を阻害するための理想的な治療アプローチとしても想定できることを示しています。

EL-2 抗体ではなく、EL-6 抗体で免疫したマウス (2 つの異なる販売業者から入手) の血液および脾臓組織における細菌量の減少の観察は、EL-6 領域で節足動物 IsOATP4056 を遮断すると A. ファゴサイトフィルムの感染が損なわれることを明らかに示しています。マダニから脊椎動物のネズミの宿主まで。 EL-6 領域がティック単位の IsOATP4056 機能において重要な役割を果たす可能性があるいくつかのシナリオが想定できます。 まず、EL-6 は細菌の細胞からの脱出を促進している可能性があり、この領域をブロックすると A. ファゴサイトフィルムの感染に影響を与える可能性があります。 第二に、EL-6 領域は Toll 経路シグナル伝達を抑制する可能性があり、IsOATP4056 でこの領域をブロックすると TOLL 経路が活性化され、細菌量の減少につながる可能性があります。 第三に、EL-6 領域は XA 輸送に関与している可能性があります。 XA はダニおよびダニ細胞における A. phagocytophilum の定着に不可欠です 35,37。 したがって、EL-6 領域をブロックすると、A. ファゴサイトフィルムの生存とダニ細胞からの脱出に影響を与える可能性があります。 これらの仮説のいずれかまたはすべてを考慮すると、EL-6 領域で IsOATP4056 をブロックすることは、ダニから脊椎宿主への A. phagocytophilum の伝播を阻害する効果的なアプローチであると考えられます。

要約すると、この研究は、節足動物の膜輸送体 IsOATP4056 を標的とすることが、マダニから脊椎動物宿主への A. ファゴサイトフィルムの感染に影響を与えるという証拠を提供します。 このような研究は、媒介ダニ分子と病原体相互作用におけるダニ分子の役割を理解するために重要であるだけでなく、医学的に重要なダニ媒介者からヒトへのA.ファゴサイトフィルムやおそらく他の病原体の伝播を標的とする抗ベクターワクチンの開発にもつながります。脊椎動物の宿主。

この研究全体を通じて、アナプラズマ ファゴサイトフィラム株 NCH-1 を使用しました。 この株は、NIH、NIAID、BEI Resources から入手しました。 アナプラズマ ファゴサイトフィルムは、我々の以前の研究で説明されているように、ヒト前骨髄球細胞株 (HL-60 細胞) で維持されました 35、38、44。 HL-60 細胞株は米国 ATCC から入手しました。 Ixodes scapularis 幼虫は、NIH、NIAID、BEI Resources から入手しました。 伝播研究は、A.ファゴサイトフィラムに感染した脱皮した未給餌幼虫を用いて行われた。 米国ATCCから入手したダニ細胞株ISE6を、この研究全体を通じて使用した。 ダニ細胞株は、以前の研究で説明されているように維持されました 35、38、44。 ダニの飼育は、米国パラメータ ジェネレーション アンド コントロール社の環境チャンバーで行われました。 インキュベーターは 23 ± 2 °C、相対湿度 94%、明:暗 14:10 の条件に設定されました。

この研究で使用した IsOATP4056 ポリクローナル抗体は、商業施設 (GenScript、米国) で生成されました。 細胞外ループ2 (NVTRIEDENTCQMP) および3'システインを含む6 (TWRHKRELKEAPPLC) のIsOATP4056領域に対応するペプチドを使用して、それぞれEL-2およびEL-6抗体を生成しました。 抗体は滅菌濾過されており、防腐剤は含まれていません。 抗体を受け取ったら、コントロール、EL-2 または EL-6 抗体を水に可溶化し、動物実験に使用しました。 15または30μg/マウスのEL-2またはEL-6または対照IgG抗体溶液の体積を、0.9%塩化ナトリウムを用いて100μlの注射体積に調整した。

この研究では、C3H/HeN (雌マウス、4 ～ 6 週齢、CharlesRiver Laboratories、米国) および C3H/HeNHsd (雌マウス、4 ～ 6 週齢、Envigo) を使用しました。 B6.129S7-Rag1tm1Mom/J マウス (Jackson Laboratories、米国) を使用して、A. ファゴサイトフィルム感染を維持しました。 幼虫のマダニに未感染マウスまたはA.ファゴサイトフィルム感染マウスを与えて幼虫に脱皮させた。 給餌されていないA.ファゴサイトフィラムに感染した若虫を、対照のEL2またはEL6抗体で免疫化したマウスに給餌した。 簡単に説明すると、ダニを配置する1日前に、4匹のC3H/HeNまたはC3H/HeNHsdマウスのグループに15μg/マウスの対照、EL-2またはEL-6抗体を注射(腹腔内、腹腔内)した。 免疫実験の概略説明は主要図のパネルとして提供されます。 免疫後 1 日後、A. ファゴサイトフィラムに感染したダニ 10 匹を各免疫マウスに与えました。 充血したダニを補充後に収集し、RNA、DNA、またはタンパク質の抽出処理を行って、それぞれダニの自然免疫遺伝子発現、細菌負荷、および抗体の摂取量を決定するための ELISA を分析しました。 ダニを配置してから 7 日目 (免疫後 8 日目) にマウスを安楽死させ、細菌量を評価するために血液および脾臓組織を収集して DNA 抽出用に処理しました。 2 番目の実験セットでは、1 群あたり 4 匹の C3H/HeNHsd マウスの群を対照、EL-2 または EL-6 抗体 (30 μg/マウス) で免疫し、免疫後 1 日目に、各マウスに 15 匹の未感染若虫を与えました。 満腹したダニを補充後に収集し、脱皮効率を評価するために環境チャンバーで培養しました。 脱皮の割合は、脱皮のために孵化した満腹幼虫の数に対する脱皮した成虫の数に基づいて決定されました。

この研究におけるすべての動物実験は、許可番号 2801-0221 でテネシー大学施設内動物管理使用委員会 (IACUC) から承認された動物プロトコルに基づいて行われました。 動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。 ダニの摂食中の動物の苦痛を最小限に抑えるために、アセプロマジンが精神安定剤として使用されました。

ダニ細胞株 ISE 6 は、以前の研究で説明したように LI5B300 培地で維持されました 35,37。 簡単に説明すると、感染の 1 日前に 2 × 105 細胞/ウェルを細胞培養プレートに播種しました。 インビトロダニ細胞感染の場合、IMDM培地で維持したHL-60培養物からA.ファゴサイトフィルムを単離しました。 宿主細胞を含まない A. ファゴサイトフィラムを記載どおりに単離しました 30、35、51。 簡単に説明すると、A.ファゴサイトフィラムに感染したHL-60細胞を3005gで10分間遠心分離した。 細胞ペレットをIMDM培地に再懸濁し、-80℃の冷凍庫で10分間インキュベートして、細胞の溶解を増加させました。 細胞を 27 ゲージの注射器に 6 ～ 8 回通過させて細菌を放出しました。 細胞破片を２７０ｇで３分間遠心分離することによってペレット化し、上清を収集した。 インビトロ細胞株感染の場合、12ウェル細胞培養プレート中で4×105個の感染HL-60細胞から単離したA.ファゴサイトフィルムを2×105個/ウェルのダニ細胞/ウェルに感染させた。 抗体ブロッキングアッセイでは、抗体で処理する 1 日前に 2 × 105 / ダニ細胞 / ウェルを播種しました。 抗体 (5 または 10 μg/ml) を、培養ウェルに添加する前に 50 μl の滅菌 1x PBS に再懸濁しました。 抗体処理の 24 時間後、細胞を A. ファゴサイトフィルムに感染させました。 感染後 24 時間後にダニ細胞を収集し、遺伝子発現と細菌負荷をそれぞれ評価するために RNA と DNA を抽出するために処理しました。

免疫ブロット法は記載どおりに実行されました 30。 簡単に説明すると、ウサギポリクローナルEL-2およびEL-6抗体を用いて、未感染またはA.ファゴサイトフィルム感染ダニ全体またはダニ細胞溶解物中のIsOATP4056レベルを分析した。 未感染のダニまたはダニ細胞と、A.ファゴサイトフィラムに感染したダニまたはダニ細胞から生成されたタンパク質溶解物は、同じ実験から得られ、並行して処理されました。 8% 分離ゲルを使用した SDS PAGE を使用し、Trans-Blot TurboTM (BioRad, USA) を使用して、パラメーターを電圧 25V、電流 2.5 A、時間 7 分に設定してブロッティングを実行しました。ブロッティングされたニトロセルロース膜は 5% BSA でブロックされました。 ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で室温で１時間反応させ、ＴＢＳＴに溶解した５％ ＢＳＡで調製した１：１０００希釈の一次抗体溶液中で一晩インキュベートした。 ブロット/クーマシー染色/ポンソー染色の完全な画像を補足図7に示します。西洋わさびペルオキシダーゼに結合した抗ウサギ二次抗体(Cell Signaling Technologies、米国)を1:5000の希釈で使用し、1時間インキュベートしました。室温で１時間。 化学発光は、ClarityTM Western ECL基質、BioRad in ChemidocTM MPイメージングシステム(BioRad、USA)を使用して測定した。 ダニ細胞サンプルの脱グリコシル化は、メーカーの指示に従って、タンパク質脱グリコシル化ミックス II (NEB-P6044S) を使用して行われました。 簡単に説明すると、ダニ細胞溶解物 10 μg を脱グリコシル化バッファー 2 0.5 μl と混合し、75 °C で 10 分間インキュベートしました。 冷却後、サンプルを 0.5 μl の Protein Deglycosylation Mix II と混合し、室温で 30 分間インキュベートし、続いて 37 °C で一晩インキュベートし、SDS PAGE およびイムノブロット用に処理しました。

それぞれのペプチドに結合する抗体の特異性を決定するために、100 ng の EL-2 または EL-6 ペプチド (GenScript、米国) を 1x PBS に溶解し、96 ウェル プレート (Nunc、ThermoFisherScientific、米国) のウェルにコーティングしました。 4℃で一晩インキュベートしました。 スクランブルペプチド（GenScript、米国）も同様の方法でコーティングしました。 空のウェルを参考として使用しました。 同様に、250 ng の非感染または A. ファゴサイトフィルム感染ダニまたはダニ細胞溶解物をプレート上にコーティングし、4 °C で一晩インキュベートしました。 すべてのウェルをブロッキング緩衝液（1x PBS中の0.1% Tween 20および1% BSA）で37℃で1時間ブロックしました。 0.05% Tween 20および0.5% BSAを含む1×PBSで調製した後、500 ngの一次抗体を各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートしました。 洗浄緩衝液 (0.05% Tween 20 を含む 1x PBS) で 3 回洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼと結合した抗ウサギ二次抗体を 1:2000 の希釈で加え、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 3回洗浄した後、100μlのペルオキシダーゼ基質(Sure BlueTM、KPL、米国)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。 続いて、50μlの停止液を添加し、CYTATION7 (BioTek, USA)で450nmで吸光度を測定した。 給餌されたダニ若虫における抗体の検出のために、EL-2 または EL-6 を給餌されたダニ、または対照抗体免疫マウスからの総タンパク質溶解物を、1 mM PMSF を含む 1x PBS 緩衝液中で生成しました。 これらの溶解産物のそれぞれ 5 マイクログラムを、EL-2 または EL-6 ペプチドでコーティングされた 96 ウェル プレートに添加しました。 4℃で24時間インキュベートした後、プレートを二次抗体処理のために処理し、続いて基質を添加し、450 nmで吸光度を読み取りました。

QRT-PCR は、以前の出版物 35、44 に記載されているように実行されました。 ダニ細胞、餌を与えられた若虫ダニ、またはマウスサンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルムの負荷は、細菌のp44遺伝子コピーの絶対量と宿主細胞内のそれぞれのアクチン遺伝子コピーの絶対量の比をとることによって測定されました。 各遺伝子断片の QRT-PCR の標準曲線は、1 ng から 0.00001 ng/ul までの範囲で作成されました。 DNAは、DNeasy血液および組織抽出キット(QIAGEN、USA)を使用して抽出した。 ダニの選択された自然免疫遺伝子の転写物負荷は、個々の転写物の絶対量とダニ 5.8 S rRNA の絶対量の比として表されました。 Aurum Total RNA Miniキット(BioRad、米国)を使用して全RNAを抽出し、iSCRIPT cDNA合成キット(BioRad、米国)を使用してcDNAを調製した。 QRT-PCR は、iQ-SYBR Green Supermix (BioRad、米国) または 2X Universal SYBR Green fast qPCR Mix (ABclonal、米国) を使用して、CFX Opus 96 (BioRad、米国) で実行されました。 以下は、ダニ pgrp の転写物を測定するために使用されるオリゴヌクレオチドです: 5' CGGCTACACGAGACCTTGCT 3' および 5' CGCGACGTGACTGGGGT 3'。 他の遺伝子については、以前に公開されたオリゴヌクレオチドが使用されました 35、38、44。

ダニ細胞 (2 × 104) を 96 黒色透明底プレート (Griener Bio One、ThermoFisherScientific、米国) の各ウェルに播種しました。 播種後 24 時間後、A. ファゴサイトフィルムをダニ細胞の 1 つのグループに感染させました。 感染後 24 時間後、非感染ダニ細胞と A. ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞を免疫蛍光のために処理しました。 IsOATP4056 の局在を特定するために、未感染または A. ファゴサイトフィラム感染ダニ細胞を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、0.2% Triton X-100 で透過処理し、3% BSA でブロックしました。 EL-6 抗体を 1:250 希釈で使用し、続いて抗ウサギ alexa594 結合二次抗体 (Molecular Probes、ThermoFisher Scientific、米国) で 1:2500 希釈で処理しました。細胞はさらに DAPI (Invitrogen、Invitrogen) で染色しました。 ThermoFisher Scientific、米国）および画像は、CYTATION7 イメージャー（BioTek、米国）の 40 倍の対物レンズでキャプチャされました。

生死アッセイおよび MTT アッセイは、以前の出版物 46、52 に記載されているように実行されました。 簡単に説明すると、3 × 104 個のダニ細胞を 96 ウェル プレート (Griener Bio One、ThermoFisherScientific、米国) の各ウェルに播種しました。 プレーティングの 1 日後、細胞を 5 μg/ml または 10 μg/ml の EL-2 または EL-6 抗体で処理しました。 抗体処理の 1 日後、細胞死アッセイを実施しました。 Live/Dead アッセイ (LIVE/DEADTM Cell Imaging キット、Invitrogen) の場合、緑と赤のバイアルの内容物を説明書に従って混合し、1/4 希釈で培地に加えました。 15 分間のインキュベーション後、CYTATION7 イメージャー (BioTek、米国) の 20 倍の対物レンズを使用して細胞の蛍光を画像化しました。 MTT アッセイの場合、1x PBS 中の 5 mg/ml の MTT 試薬 (Sigma、米国) を総量の 10% で細胞に添加しました。 プレートを37℃で4時間インキュベートし、DMSOを培地の半分の量で添加しました。 5分間混合した後、570 nmおよび690 nmでの吸光度を測定しました。 690 nm での値を 570 nm でのそれぞれの値から減算し、グラフをプロットしました。

モックまたは myd88-dsRNA 合成は、記載されているように実行されました 35,38。 簡単に説明すると、myd88-dsRNA フラグメントは、それぞれ BglII および KpnI 部位を含む 5' CCAGATCTGTCCATCAAGAGCAGTGGCA 3' および 5' CGGGTACCACCATTGTGAAGGAGCACCA 3' を使用する PCR によって生成されました。 得られた PCR 産物を、記載されているように pL4440 ダブル T7 Script II ベクターにクローニングしました 29,30。 その後、製造業者の指示に従って、MEGAscript RNAi Kit (Ambion Inc.) を使用して、得られたクローンを dsRNA 合成のために処理しました。 myd88-dsRNA の ISE6 ダニ細胞へのトランスフェクションは、記載されているように 2 マイクロリットルの FuGENE 6 トランスフェクション試薬 (Promega, USA) を用いて実施されました 35,38。 簡単に説明すると、2 × 105 個の細胞を 12 ウェル プレートの L15B300 培地に播種しました。 一晩インキュベートした後、750 ngのmyd88 dsRNAをFuGENE 6トランスフェクション試薬と混合し、各ウェルに加えました。 4時間後、EL-6抗体の有無にかかわらず、2×L15B300培地を添加し、一晩インキュベートした。 インキュベーション後、無細胞 A. ファゴサイトフィルムを添加し、感染後 24 時間後にサンプルを収集しました。 サンプルを RNA 抽出および DNA 抽出のために処理し、それぞれ myd88 発現と細菌負荷を定量化しました。

すべてのデータセットは、GraphPad Prism 5 ソフトウェア (www.graphpad.com) を使用して統計的に分析されました。 対応のないスチューデント t 検定は、実験データセットを 2 つの変数と比較するために考慮されました。 <0.05 の p 値は有意とみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。

Rochlin, I. & Toledo, A. 公衆衛生上重要な新興ダニ媒介病原体: ミニレビュー。 J.Med. 微生物。 69、781–791 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Steere、AC et al. ライムボレリア症。 ナット。 牧師押す堅苦しい。 2、16090 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

パテル、M.ら。 インドにおける新興および再興ウイルス感染症。 J. 前へ医学。 ヒュグ。 62、E628–E634 (2021)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodino, KG、Theel, ES、Pritt, BS 米国におけるダニ媒介性疾患。 クリン。 化学。 66、537–548 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

趙、GP 他。 中国におけるダニとダニ媒介性病原体のマッピング。 ナット。 共通。 1075 年 12 月 (2021 年)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neelakanta, G. & Sultana, H. 感染阻止ワクチン: ダニ媒介性疾患に対する抗ベクター ワクチンに焦点を当てる。 アーチ。 イムノール。 それで。 経験値 (Warsz.) 63、169–179 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リベイロ、CM 他マダニにおけるリケッチア・リケッチアの蔓延：体系的レビューとメタ分析。 ベクター媒介人獣共通感染症。 21、557–565 (2021)。

PubMed Google Scholar

Gilbert, L. ダニおよびダニ媒介性疾患のリスクに対する気候変動の影響。 アヌ・エントム牧師。 66、373–388 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mlera, L. & Bloom, ME ダニ媒介フラビウイルス生物学における哺乳類の保有宿主の役割。 フロントセル感染。 微生物。 8、298 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

アンダーソン、JF & マグナレッリ、LA マダニの生物学。 感染する。 ディス。 クリン。 北午前。 22、195–215 (2008)。

論文 PubMed Google Scholar

クンツ、SE & ケンプ、DH 殺虫剤と殺ダニ剤: 耐性と環境への影響。 科学牧師。 技術。 13、1249–1286 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ピュー、SJ 他ダニ媒介性脳炎（TBE）ワクチンの2回接種の有効性。 J.トラベルメッド。 29、https://doi.org/10.1093/jtm/taab193 (2022)。

de la Fuente, J. & Contreras, M. ダニワクチン：現状と将来の方向性。 専門家 Rev. Vacc 14、1367–1376 (2015)。

記事 Google Scholar

Smit, R. & Postma, MJ ダニ媒介性疾患のワクチンとワクチン接種の費用対効果: 疾患の負担を軽減するための公衆衛生上の課題。 Vacc 専門家 Rev. 15、5–7 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ムタイラー、S. et al. マダニの同時感染: 例外ではなく規則。 PLoSネグル。 トロップ。 ディス。 10、e0004539 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Civitello、DJ、Rynkiewicz、E. & Clay、K. マダニの同時感染のメタ分析。 イスル。 Ｊ．Ｅｃｏｌ． 進化。 56、417–431 (2010)。

記事 Google Scholar

ノースカロライナ州ニエトら。 市民科学を利用して、米国におけるダニ咬傷の蔓延と分布、およびダニ媒介性疾患への曝露を説明します。 PLoS One 13、e0199644 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

de la Fuente, J.、Kopacek, P.、Lew-Tabor, A. & Maritz-Olivier, C. マダニおよびダニ媒介疾患に対する新規および改良ワクチンの戦略。 寄生虫免疫。 38、754–769 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Merino, O.、Alberdi, P.、Perez de la Lastra、JM & de la Fuente、J. ダニワクチンとダニ媒介病原体の制御。 フロントセル感染。 微生物。 3、30 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

デ・ラ・フエンテ、J. 他ベクターの侵入と病原体伝播を制御するための万能ワクチンの開発のため、節足動物のサブオレシン/アキリンをターゲットにしています。 獣医。 パラシトール。 181、17–22 (2011)。

論文 PubMed Google Scholar

Neelakanta, G. & Sultana, H. ダニの唾液と唾液腺: 節足動物の吸血と病原体伝播におけるそれらの役割について、これまでにわかっていること。 フロントセル感染。 微生物。 11、816547 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

van Oosterwijk、JG 抗ダニおよび病原体の感染をブロックするワクチン。 寄生虫免疫。 43、e12831 (2021)。

PubMed Google Scholar

Ndawula, C. Jr. & Tabor, AE カクテル抗ダニワクチン: 予期せぬ制約と有効性向上へのアプローチ。 ワクチン (バーゼル) 8、https://doi.org/10.3390/vaccines8030457 (2020)。

ナラシンハン、S. 他獲得されたダニ耐性: トレイルは暑いです。 寄生虫免疫。 43、e12808 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Bakken, JS & Dumler, JS ヒト顆粒球性アナプラズマ症。 感染する。 これ。 クリン。 北午前。 改訂第 29 巻、341–355 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ダムラー、JS et al. ヒト顆粒球性アナプラズマ症およびアナプラズマ・ファゴサイトフィルム。 出現。 感染する。 ディス。 11、1828–1834 (2005)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Carlyon, JA & Fikrig, E. アナプラズマ・ファゴサイトフィラムの侵入と生存戦略。 細胞微生物。 5、743–754 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

力久、Y. アナプラズマ ファゴサイトフィルムによる義務的細胞内感染のメカニズム。 クリン。 微生物。 改訂第 24 巻、469–489 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neelakanta, G.、Sultana, H.、Fish, D.、Anderson, JF & Fikrig, E. アナプラズマ・ファゴサイトフィルムは、マダニの寒冷下での生存を高める不凍糖タンパク質遺伝子の発現をマダニに誘導します。 Ｊ．クリン． 投資する。 120、3179–3190 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スルタナ、H.ら。 Anaplasma phagocytophilum はアクチンリン酸化を誘導し、マダニの遺伝子転写を選択的に制御します。 J.Exp. 医学。 207、1727–1743 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デ・ラ・フエンテ、J. 他ダニと病原体の相互作用とベクター能力: ダニ媒介性疾患の分子ドライバーの同定。 フロントセル感染。 微生物。 7、114（2017）。

PubMed PubMed Central Google Scholar

オリバ・チャベス、AS 他 O-メチルトランスフェラーゼは、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムによるダニ細胞の感染に必要です。 PLoS 病巣。 11、e1005248 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Neal, AJ、Singh, N.、Mendes, MT & Pedra, JHF アナプラズマ属: ダニと病原体の相互作用の幕引き。 病原菌。 ディス。 79、https://doi.org/10.1093/femspd/ftab022 (2021)。

Rosche, KL、Sidak-Loftis, LC、Hurtado, J.、Fisk, EA & Shaw, DK 圧力下の節足動物: 病原体とベクターの境界面におけるストレス反応と免疫。 フロントイミュノール。 11、629777 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Taank、V. et al. ヒトリケッチア病原体は、マダニの中で生存するために、ポリペプチドおよびトリプトファンを輸送する節足動物の有機アニオン経路を調節する。 科学。 議員 7、13256 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Taank、V. et al. 細菌およびウイルス感染時のダニ有機陰イオン輸送ポリペプチド（OATP）の特性評価。 寄生虫。 ベクター 11、593 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dahmani, M.、Anderson, JF、Sultana, H. & Neelakanta, G. リケッチア病原体は、節足動物のトリプトファン経路代謝産物を使用してダニ細胞内の活性酸素種を回避します。 細胞微生物。 22、e13237 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramasamy, E.、Taank, V.、Anderson, JF、Sultana, H. & Neelakanta, G. ダニの microRNA-133 の抑制は、ベクター内でのアナプラズマ ファゴサイトフィルムの生存と脊椎動物宿主への伝達に重要な有機アニオン輸送ポリペプチドの発現を誘導します。 PLoS Genet 16、e1008856 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hagenbuch, B. & Meier, PJ OATP/SLC21 ファミリーの有機アニオン輸送ポリペプチド: OATP/ SLCO スーパーファミリーとしての系統分類、新しい命名法および分子/機能的特性。 プラグ。 アーチ。 447、653–665 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Kalliokoski, A. & Niemi, M. 薬物動態に対する OATP トランスポーターの影響。 Br. Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 158、693–705 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

ニガム、SKら。 有機アニオントランスポーター (OAT) ファミリー: システム生物学の観点から。 生理。 改訂 95、83–123 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Stieger, B. & Hagenbuch, B. 有機アニオン輸送ポリペプチド。 カー。 上。 膜 73、205–232 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roth, M.、Obaidat, A. & Hagenbuch, B. OATP、OAT、および OCT: SLCO および SLC22A 遺伝子スーパーファミリーの有機アニオンおよびカチオントランスポーター。 Br. Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 165、1260–1287 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Khanal, S.、Taank, V.、Anderson, JF、Sultana, H. & Neelakanta, G. リケッチア病原体は概日遺伝子を混乱させて脊椎動物の宿主に感染します。 内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 23、https://doi.org/10.3390/ijms23073545 (2022)。

de la Fuente, J. ダニおよびダニ媒介疾患の制御のためのトランスレーショナル バイオテクノロジー。 カチカチ。 ボーンディス。 12、101738 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Namjoshi, P.、Dahmani, M.、Sultana, H. & Neelakanta, G. リケッチア病原体は、トリプトファン代謝物を介した p38 MAP キナーゼの活性化を通じてダニ細胞死を阻害します。 iScience 26、105730 (2023)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、W.ら。 ヒト有機陰イオン輸送ポリペプチド 1A2 (OATP1A2) の多型: 薬物動態の変化と中枢神経系への薬物侵入への影響。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 280、9610–9617 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Y.、Boxberger, KH & Hagenbuch, B. 有機アニオン輸送ポリペプチド 1B3 は、ホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーを形成できます。 PLoS One 12、e0180257 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, N.、Choudhuri, S.、ニュージャージー州チェリントン、CD Klaassen トール様受容体 4 (TLR4) を介したリポ多糖によるマウス有機アニオン輸送ポリペプチド 4 (Oatp4; Oatp1b2; Slc21a10) mRNA の下方制御。 薬物メタブ。 処分します。 32、1265–1271 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヴォラ、A.ら。 マダニは、異なる免疫バックグラウンドを持つ宿主を食べると、さまざまな線溶活性を引き起こします。 科学。 議員 7、44593 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas, V. & Fikrig, E. Anaplasma phagocytophilum は、感染中に ROCK1 のチロシンリン酸化を特異的に誘導します。 細胞微生物。 9、1730–1737 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dutta, S. et al. 銅(II)およびコバルト(III)金属中心への異なるリガンドの配位は、節足動物細胞とヒト角化細胞の両方におけるジカウイルスおよびデング熱ウイルスの負荷を強化します。 ビオチンの生物物理学。 Acta Gen. 臣下 1862 年、40 ～ 50 年 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIH を通じて入手しました: Ixodes scapularis 幼生 (生)、NR-44115 および Anaplasma phagocytophilum、NCH1 株、NR-48807。 この研究は、国立アレルギー感染症研究所 (NIAID)、国立衛生研究所 (NIH) から GN への資金提供 (受賞番号: R01AI130116) とテネシー大学ノックスビル校から HS と GN への資金によって支援されました。

米国テネシー州ノックスビル、テネシー大学獣医学部生物医学診断科学科

PP マヘシュ、プラチ ナムジョシ、ハメーダ サルタナ & ギリッシュ ニーラカンタ

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PPM、PN、GN が実験を実施しました。 PPM、PN、HS、GN がデータを分析しました。 PPM、HS、GN が研究を設計し、HS と GN が試薬を提供しました。 著者全員が原稿を読み、編集し、承認しました。 PPM と GN が論文を執筆しました。 GN は研究を概念化し着想し、調査全体を監督しました。

ギリッシュ・ニーラカンタへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Mahesh、PP、Namjoshi、P.、Sultana、H. 他。 節足動物タンパク質に対する免疫化は、マダニから脊椎動物宿主へのリケッチア病原体の伝播を妨げます。 npj ワクチン 8、79 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41541-023-00678-y

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受信日: 2022 年 9 月 16 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 5 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00678-y

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