SARS | Chuzhou Research Chemical Inc.

Communications Biology volume 6、記事番号: 556 (2023) この記事を引用

624 アクセス

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

2021 年末に Omicron の亜種が出現して以来、それらはすぐに世界中で支配的な亜種になりました。オミクロンの変異株は、初期の武漢や他の変異株と比べて感染しやすい可能性がある。この研究では、Omicron 変異体に関連する感染力の変化のメカニズムを解明することを目的としました。我々は、スパイクの S2 配列に位置する変異を体系的に評価し、ウイルス融合の変化の原因となる変異を同定しました。我々は、S1/S2 切断部位付近の変異により S1/S2 切断が減少し、その結果、融合誘導性が低下することを実証しました。 HR1 およびその他の S2 配列の変異も細胞間融合に影響を与えます。核磁気共鳴（NMR）研究およびコンピュータでのモデリングに基づくと、これらの変異はウイルス融合の複数の段階で融合形成性に影響を与える可能性があります。我々の発見により、Omicron 変異体には、合胞体形成の減少、ひいては病原性の減弱に寄与する変異が蓄積されていることが明らかになりました。

SARS-CoV-2 のオミクロン変異株 BA.1 は、2021 年末に南アフリカで最初に報告され、2021 年の初めにはすぐに主要な懸念される変異株 (VOC) となりました 21。最近のデータは、それが高症例数と相関していることを示しました。数値が高く、中和抗体に対する反応が低い1。アルファ (B.1.1.7)、ベータ (B.1.351)、ガンマ (P.1)、デルタ (B.1.617.2)、およびオミクロン (当初は B.1.1.529、BA に再分類) を含む 5 つの VOC があります。系統）のほか、2021 年 12 月時点の世界保健機関に基づく Lambda (C.37) と Mu (B.1.621) を含む 2 つの対象変異体 (VOI) も含まれます2。VOC の中では、BA.1 変異体と関連変異体 ( BA.2、BA.4、BA.5）は、2022 年に主に流行している変異株として出現しており、そのスパイクタンパク質には 30 を超える変異が含まれています。 BA.1 の場合、N 末端ドメインと受容体結合ドメイン (RBD) に 20 を超える変異が存在します。次の 5 つの変異 (T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H) はサブドメイン 1/2 または S1/S2 切断部位 (R685) の近くに位置し、最後の 6 つの変異 (N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、およびL981F）は、S2'切断部位（R815）およびHR1（ヘプタドリピート1）領域の周囲に位置しています3。

B.1.1.7 および B.1.617.2 変異体のスパイクタンパク質は、S1/S2 切断を改善するフューリン切断部位近くに位置する変異により、武漢株と比較して細胞間融合においてより効率的であることが報告されています。効率4,5。ウイルス誘導性合胞体形成は病因および疾患の重症度と関連付けられているため、B.1.1.7 および B.1.617.2 変異体のより高い病原性は、より効率的な合胞体形成と関連しています6。一方で、BA.1 は他の VOC と比較して臨床的に感染性が高いと考えられており、最近のデータでは、BA.1 変異体の再感染率とワクチン突破率が高いことが明らかになりました。これはおそらく、既存の中和抗体に対する耐性のためです 1。 7。興味深いことに、BA.1 バリアントは、B.1.617.2 バリアントと比較して、より深刻な疾患と関連しています 8。合胞体形成と病因との関係に基づいて、BA.1 変異体は合胞体形成能力が低い可能性があるという仮説が立てられました。しかし、合胞体の形成に関するその後の研究は物議を醸しています9,10。 B.1.1.7 および B.1.617.2 変異体のフューリン切断部位近くの変異により S1/S2 切断効率が向上したため、BA.1 変異体の合胞体形成の減少はフューリン切断部位近くの変異の結果である可能性があると仮説を立てています。その結果、S1/S2 切断の効率が低下します。

最近の研究では、BA.1 変異体における中和抗体のエピトープおよびスパイクタンパク質の RBD に影響を与える変異について報告されています 11、12。ここでは、BA.1 変異体の生物学的特性を調べ、主に細胞間融合アッセイを使用したスパイク媒介融合に焦点を当てました。我々は、合胞体形成の減弱は、フューリン切断部位付近の変異だけではなく、HR1領域内およびその周囲の変異も原因であることを示した。変異の多くは S1/S2 切断に影響を与えますが、HR1 領域の一部の変異はウイルスによって誘導される融合プロセスに直接影響を与えるようです。これらの変異を総合すると、BA.1 変異体の病原性表現型の変化をおそらく説明できます。

すべての主要な SARS-CoV-2 変異体のスパイクタンパク質配列を並べると、他の変異体と比較して、BA.1 および関連変異体のスパイク配列全体に多くの変異がはるかに一般的に存在しており、その多くは細胞を媒介する S2 ドメインに影響を与えることが示されています。 -S1ドメインによる受容体結合後の細胞融合（補足図1）。これまでの研究では、BA.1 変異株は SARS-CoV-210 の祖先株 (武漢) よりも融合原性が低いことが示唆されています 13。 BA.1 および武漢、B.1.1.7、B.1.351、および B.1.617.2 を含むそれ以前の系統の融合原性を確認するために、SmBit-LgBit (スプリットルシフェラーゼ) および私たちの研究室で以前に開発された GFP-RFP システム14。また、組換えレンチウイルスを使用してSタンパク質を構成的に発現させ、抗生物質マーカーによってS発現構築物をトランスフェクトした細胞を選択することも以前に試みましたが、それらの戦略は成功しませんでした。しかし、以前に開発した一過性トランスフェクションシステムは高いトランスフェクション効率を保証したため、残りの実験にはこのシステムを使用することにしました。これらのシステムでは、C 末端切断型 (より効率的な細胞表面局在化) と完全長 S コンストラクトの両方がテストされました。簡単に説明すると、ドナー細胞 (HeLa 細胞) は S-SmBit または S-GFP 融合タンパク質を発現し、レシピエント細胞 (293ACE2) は LgBit または RFP を発現します。 HeLa 細胞は ACE215 を発現しないため、自己融合しません。共焦点顕微鏡検査は、ドナーHeLa細胞におけるスパイクタンパク質の同様の発現を示しています（補足図2a）。ドナー細胞とレシピエント細胞の融合が成功すると、SmBit と LgBit の相互作用、および GFP と RFP の共局在による黄色蛍光シグナルにより発光シグナルが検出されます。予想通り、SmBit-LgBit システム (図 1a) と GFP-RFP システム (図 1b、c) の両方で BA.1 が著しく低い融合原性を示すことが観察されました。 GFP-RFP共局在シグナルはImageJによって定量化され、図1bに示されています。全体として、C 末端切断型 S バリアントは、予想どおり、非切断型 S バリアントと比較して高い融合原性を示しました（補足図 3）。

a SARS-CoV-2 バリアント S を使用して細胞間融合アッセイを実行しました (「方法」を参照)。さまざまな短縮型 S-SmBit トランスフェクトドナー (HeLa) 細胞と LgBit トランスフェクトレシピエント (293ACE2) 細胞をトランスフェクションの 24 時間後に混合し、48 時間インキュベートしました。インキュベーション後、POLARstar Omegaプレートリーダーにより発光シグナルを測定した。すべてのデータポイントは平均値 (標準偏差 (SD)、n = 8 生物学的に独立した反復) として表示されます。 b、c 同様に、さまざまな S-GFP トランスフェクトドナー (HeLa) 細胞と RFP トランスフェクトレシピエント (293ACE2) 細胞をトランスフェクションの 24 時間後に混合し、さらに 48 時間インキュベートしました。インキュベーション後、CellSens 蛍光顕微鏡を使用して、GFP と RFP 間の共局在シグナルを測定しました。 GFP-SmBit 発現プラスミドを対照としてドナー (HeLa) 細胞にトランスフェクトしました。定量化のために、融合活性を測定するために 10 個のフィールドがランダムに選択されました (n = 10)。共局在シグナルはImageJによって定量化されました。統計的比較のために、調整された P 値を示します (対武漢、*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: 有意ではありません)。すべての結果は 3 つの独立した実験の代表です。スケールバーは50μm。 d さまざまな短縮型 S-SmBit トランスフェクトドナー (HeLa) 細胞と LgBit トランスフェクトレシピエント (293ACE2) 細胞をトランスフェクションの 24 時間後に混合し、5 つの異なる濃度 (30 μg/mL、10 μg/mL、3 μg/mL) で処理しました。 mL、1 μg/mL、0.3 μg/mL）の抗 S 抗体。混合から48時間後、POLARstar Omegaプレートリーダーを使用して発光シグナルを測定した。すべてのデータポイントは平均値として表示されます (SD、n = 4 生物学的に独立した反復)。

S2ドメインを標的とする中和ポリクローナル抗S抗体は、同様にすべてのSARS-CoV-2変異体の融合をブロックした（図1d）。 25-ヒドロキシコレステロール（25-HC）、イトラコナゾール、ジクロルシクリジンなどの以前に記載された融合阻害剤は、SARS-CoV-2変異体の融合活性の同様の用量依存性阻害を示しました（補足図4）14、16。また、SARS-CoV-2変異体の異なる融合活性は、ウェスタンブロットアッセイによる変異型間の同等の総スパイクタンパク質発現レベル（図4a）と、共焦点顕微鏡で観察された変異型間の同様の細胞分布パターンによって裏付けられていることも確認しました。 (補足図2a)。次に、スパイクタンパク質の発現による潜在的な細胞毒性をテストしましたが、変異体間に有意な違いは観察されませんでした（補足図2b）。さらに、SARS-CoV-2 S でコーティングされた水疱性口内炎ウイルス (VSV) 偽粒子を使用して変異体の感染力を測定したところ、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2、および BA.1 が全体的に高い感染力を示したことがわかりました。武漢の祖先株（補足図5）。感染性 BA.1 の感染力は、試験した細胞株に依存しているようです 10、17、18。興味深いことに、BA.1の融合原性は武漢よりも大幅に低かったにもかかわらず、その感染力は我々のシステムでは武漢より高くないにしても同等でした。 BA.1 の高い感染力は、ACE210 に対する高い親和性を与える受容体結合ドメインなどの S1 領域の変異によるものと考えられます。より高い受容体結合とより低い融合原性の複合効果により、依然としてより高い感染力が得られる可能性があります。

以前の研究では、SARS-CoV-2 に感染した細胞が細胞表面でスパイクタンパク質を発現し、隣接する ACE2 陽性細胞と合胞体を形成することが示されました 19。 SARS-CoV-2 感染細胞における合胞体の形成を確認し、さまざまな SARS-CoV-2 変異体の融合原性をテストするために、生ウイルス融合アッセイを実施しました。このアッセイでは、ACE2 および TMPRSS2 を安定に発現する Huh7.5 細胞株 (Huh7.5-A2T2) を GFP プラスミドでトランスフェクトし、抗生物質 G418 によって選択しました。次に、この安定した細胞株にさまざまな SARS-CoV-2 変異体を感染させました。感染から 24 時間後、合胞体形成が検出されました (図 2a)。パックされた 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジラクテート (DAPI、核) 染色は、シンシチウム (GFP ブロッブ) として表され、各挿入図では拡大されています。 B.1.1.7 および B.1.617.2 変異体感染細胞ではより高い融合原性が検出され、BA.1 変異体ではより低い融合原性が示されました。 B.1.351 変異体は武漢株と比較して有意な差を示さなかった。定量化のために、20のフィールドがランダムに選択され、融合原性は、DAPI染色された核の数をGFPブロブの数で割ることによって定量化されました（図2b）。まとめると、SARS-CoV-2変異体は、図1a、bで報告されたS誘発細胞間融合アッセイの結果と同様の融合挙動を示しました。

a GFP を発現する Huh7.5-A2T2 細胞を 96 ウェルプレートに播種しました。播種から 24 時間後、細胞を SARS-CoV-2 変異体に感染させ、2 時間インキュベートしました。 2 時間後に細胞を洗浄し、さらに 22 時間インキュベートした後、4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定しました。インキュベーション後、DAPI を核染色に使用しました。 GFP および DAPI シグナルは CellSens 蛍光顕微鏡を使用して評価されました。 b 定量化のために、融合活性を測定するために 20 のフィールドがランダムに選択されました (n = 20)。融合原性は、DAPI 核の数を GFP ブロッブの数で割ることによって定量化されました。 GFPブロブの数をカウントするために、1つの連続するGFPブロブを1つの融合細胞または非融合細胞としてカウントした。ブロッブ内に不連続な GFP シグナル強度または不連続な円形ブロブ形状の GFP シグナルがある場合、それらを別々にカウントして、融合していない隣接細胞と融合細胞を区別しました。位置ごとの DAPI 核と GFP ブロッブの平均数が追跡されます。武漢 (DAPI: 103.7、GFP: 19.4)、B.1.1.7 (DAPI: 98.3、GFP: 12.0)、B.1.351 (DAPI: 86.4、GFP: 14.3)、B.1.617.2 (DAPI: 122.6、GFP) ：11.0）、BA.1（DAPI：68.6、GFP：23.0）、モック（DAPI：68.2、GFP：29.0）。統計的比較のために、調整された P 値を示します (対武漢、*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: 有意ではありません)。すべての結果は 3 つの独立した実験の代表です。スケールバーは50μm。

BA.1 バリアントにおける変異の影響を調査するために、武漢または BA.1 スパイク配列に個別または組み合わせの変異を導入しました。まず、BA.1 スパイクシーケンスに個々の変異を導入しました。 BA.1バリアントの30を超える変異（補足図1）のうち、C末端の11個の変異を追求することにしました。これは、S1 / S2、S2'切断部位、およびHR1に近いため、融合活性に影響を与える可能性があります。地域。これら 11 個の変異のうちの 2 個の変異 (D614G および P681H) は、以前の研究ですでに特徴付けられています 20、21、22。したがって、他の 9 つの変異を調査しました。これら 9 つの変異は、各変異を武漢配列に戻すために、BA.1 スパイク配列に個別に導入されました。このうち、アミノ酸 547 (K547T)、655 (Y655H)、856 (K856N)、954 (H954Q)、および 969 (K969N) の復帰変異は、元の BA.1 変異体と比較して高い融合誘発性を示し、これらの変異がBA.1バリアントの融合誘発性の低下の原因となっています（図3a）。興味深いことに、アミノ酸981の復帰突然変異（F981L）は、BA.1バリアントと比較して低い融合誘発性を示し、この突然変異がBA.1バリアントの他の機能低下突然変異を補うために出現した可能性があることを示唆しています（図3a））。他の 3 つの変異 K679N、K764N、および Y796D は、融合活性において BA.1 変異体との顕著な差異を示さなかった。

BA.1関連S変異体を用いて細胞間融合アッセイを実施した。さまざまな短縮型 S-SmBit トランスフェクトドナー (HeLa) 細胞と LgBit トランスフェクトレシピエント (293ACE2) 細胞をトランスフェクションの 24 時間後に混合し、48 時間インキュベートしました。インキュベーション後、POLARstar Omegaプレートリーダーにより発光シグナルを測定した。 a 個々の変異が BA.1 S 配列に導入されました。対応する変異を除いて、配列の残りの部分はネイティブ BA.1 S 配列と同じです。同様に、組み合わせ変異も BA.1 S 配列に導入されました。すべてのデータポイントは平均値として表示されます (SD、n = 4 ～ 8 の生物学的に独立した反復)。統計的比較のために、調整された P 値が示されています (対 BA.1、*P < 0.05; ****P < 0.0001; ns: 有意ではありません)。すべての結果は 3 つの独立した実験の代表です。 b 武漢の S 配列に個別の変異が導入された。対応する変異を除いて、配列の残りの部分はネイティブの武漢 S 配列と同じです。同様に、武漢のS配列にも複合変異が導入された。すべてのデータポイントは平均値として表示されます (SD、n = 4 ～ 8 の生物学的に独立した反復)。統計的比較のために、調整された P 値が示されています (対武漢、**P < 0.01; ****P < 0.0001; ns: 有意ではありません)。すべての結果は 3 つの独立した実験の代表です。 c さまざまな BA.1 サブバリアント S コンストラクトの融合活性を同様に測定しました。すべてのデータポイントは平均値として表示されます (SD、n = 8 生物学的に独立した反復)。統計的比較のために、調整された P 値が示されています (対 BA.1、**P < 0.01; ****P < 0.0001; ns: 有意ではありません)。すべての結果は 3 つの独立した実験の代表です。

次に、1 セットは S1/S2 切断部位付近にあり、もう 1 セットは S2' 切断部位付近および HR1 領域にある組み合わせ変異をテストしました。 K547T および Y655H を 1 つのコンストラクトに一緒に導入し、K856N、H954Q、および K969N を別のコンストラクトに別々に組み合わせました。予想通り、組み合わせ変異体は個々の変異体と比較してより高い融合誘導性を示しました。 5つの変異をすべて組み合わせると、融合誘発性は武漢スパイク構築物よりもさらに高かった。予想どおり、推定上の代償性F981Lが5つの組み合わせた変異に導入された場合、融合原性は減少しました（図3a）。興味深いことに、K856N、H954Q、および K969N を含む変異体は、K547T および Y655H を含む変異体よりも高い融合原性を示し、S2' 切断部位付近および HR1 領域の変異が S1/S2 付近の変異よりも融合原性に対して強い影響を与えることを示唆しています。切断部位。

上記の 6 つの変異の影響を検証するために、武漢のスパイク配列に個別または組み合わせの BA.1 変異を導入しました。これらは上記の変異の逆変異であるため、それらが逆の融合誘発性パターンを持つことが予想されました。実際、アミノ酸 547 (T547K)、655 (H655Y)、856 (N856K)、および 969 (N969K) の変異は武漢株と比較して低い融合活性を示し、これらの変異が BA の融合表現型の低下の原因であることを裏付けています。 .1の亜種。予想通り、アミノ酸 981 の変異 (L981F) は武漢株よりも高い融合誘発性を示しました。アミノ酸954の変異（Q954H）は、武漢株と比較して融合誘発性の有意な低下を示さなかった（図3b）。この変異が武漢株に導入された場合、その効果を発揮するには他の変異の存在が必要である可能性がある。ここでも、組み合わせ変異は、BA.1 変異体における以前の変異分析と一致するパターンで、武漢株よりも著しく低い融合誘発性を示しました。

BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5などの他のBA.1サブバリアントの融合原性をさらに調べるために、補足図1に示すBA.1サブバリアントのスパイク配列を生成しました。 BA.5 は同じスパイクシーケンスを共有するため、BA.4/5 とラベル付けします。細胞間融合アッセイでは、BA.4/5 は融合原性のわずかな増加を示し、BA.2 および BA.2.12.1 は BA.1 変異体との有意差を示さなかった (図 3c)。

総合すると、BA.1 バリアントの融合性表現型の低下の原因となる 5 つの個別の変異と、融合性の増加に関連する 1 つの代償性変異を同定しました。また、S2' 切断部位および HR1 内またはその周囲の変異は、S1/S2 切断部位付近の変異と比較して、融合原性に対してより強い影響を与える可能性があります。最後に、BA を除くすべての BA.1 サブバリアント。 4/5 は同等の融合誘発性を持っています。

S1/S2 部位の切断の増加は、SARS-CoV-2 変異体の感染力、融合原性、および病原性の増加と関連しています 23,24。ここで我々は、上記で同定したBA.1変異がS1/S2切断の減少をもたらし、融合誘導性の低下を引き起こすかどうかを判定することを目的とする。私たちは、SARS-CoV-2 変異体およびさまざまな BA.1 関連スパイク変異体の S1/S2 切断をテストしました。これらのスパイク発現プラスミドをHuh7.5-A2T2にトランスフェクトし、全長スパイクとS2のレベルを分析しました（図4）。スパイクタンパク質のレベルは、武漢、B.1.1.7、B.1.351、および B.1.617.2 の各変異種の間で同等でした。 BA.1 スパイクタンパク質レベルは、他の変異体よりわずかに低いように見えました (図 4a)。 B.1.1.7とB.1.617.2はより高いS2レベルを示しましたが、BA.1は武漢よりも低いS2レベルを示しました（図4a）。 S1/S2 切断のこの違いは、Q954H 変異、BA.2、BA.2.12.1、および BA.4/5 を除くほとんどの変異体で細胞間融合アッセイで観察されるパターンと類似しています。すべてのBA.1サブバリアントは、BA.1のものと同様のS2レベルを示し、武漢のものよりもはるかに低かった（補足図6a）。個々の BA.1 変異のテストでは、S1/S2 切断の変動の減少が示されましたが、これは他の 2 つの細胞株でも再現可能です (図 4b および補足図 6b-c)。

Huh7.5-A2T2 細胞を、SARS-CoV-2 変異体 S 発現ベクター (a) または BA.1 関連変異体 S 発現ベクター (b) でトランスフェクトしました。トランスフェクションの 24 時間後、RIPA 溶解および抽出バッファーおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを使用して細胞を収集しました。溶解サンプルをさらに処理して、自動ウェスタンブロットシステム (Simple Western™ 自動ウェスタンブロットシステム) で S/S2 レベルを測定しました。次に、ImageJ を使用して相対信号強度を定量化しました。 β-アクチンで正規化された相対シグナル強度を、S (フル)、S2、および S2/S (フル) 比として個別にプロットしました。データは 3 つの独立した実験の代表です。

3 つの変異、Q954H、N969K、L981F は HR1 領域に存在するため、ウイルスの融合プロセスに影響を与える可能性があります。したがって、我々は、これらの HR1 変異の 1 つについて、より詳細な構造研究を実施しました。以前に、我々は、HR1領域（残基N919-Q965）が、ウイルス膜融合プロセスの脂質結合中間状態を表す可能性が高い二重層模倣体（バイセル）の存在下で膜結合らせん構造をとることを示した25。この脂質結合状態では、両親媒性 HR1 が採用する α ヘリックス構造は、互いに急速に交換される少なくとも 2 つの立体配座をサンプリングします。1 組の配座異性体は規則的な真っ直ぐな α ヘリックスを採用し、もう 1 組はねじれを含んでいます。 Q954アミノ酸位置（図5b）。 Q954H は BA.1 変異体の 1 つに対応するため、脂質結合状態と融合後の 6 ヘリックスバンドル (6HB) 状態の両方で、この変異に関連する構造変化を検索しました。我々は以前、野生型（WT）配列の脂質結合状態における骨格アミド水素交換（HX）速度を高精度で測定しました。主鎖のアミドプロトンは、安定した分子内または分子間水素結合に関与していない場合に溶媒と交換します 26。つまり、この交換率は、水素結合が一時的に破壊される時間の割合を示します。ほとんどのHR1では、Q954H変異体のHX速度は、対応するWT HR1残基のHX速度と非常に類似しており、変異体とWTの同様の動的特性が示唆されています（図5c）。 HX 速度は残基の種類とその直前の隣接する残基に敏感であるため 27、WT と変異体の HX 速度は変異部位で異なる可能性があります。この残基タイプへの依存性を除去するために、HX 速度が保護係数に変換され、これにより残基タイプへの依存性が除去されました。繰り返しますが、HR1のポリペプチド鎖の大部分について、保護因子はWTとQ954H変異体で非常に類似していることがわかりました（図5d）。しかし、Q954H 変異体では N953 ～ N955 領域で保護因子の約 3 倍の減少が観察され、この変異体がねじれた立体構造の形成に有利であることが示唆されています。残基 A944 から K964 までの HX 保護の減少ははるかに小さく、約 15% です。直線状およびねじれらせん構造は両方とも脂質結合しているため、HX 測定は、WT と比較した化学シフトのごくわずかな違いと合わせて（補足図 7）、Q954H 変異が脂質結合傾向を大きく変えないことを示しています。 HR1。 C 末端領域 (L959-V969) の化学シフト変化の増加は、Q954H 変異体のねじれた配座異性体への集団のシフトに関連しているようです。

a HR1 (残基 N919 ～ Q965) および HR2 (残基 G1171 ～ E1207) の一次アミノ酸配列を太字で示します。コア構築物では、短い柔軟なリンカー配列 (SGLVPRGSG) が HR1 と HR2 のヘリックス反復を接続します。変異部位、Glu-954 は赤色で示されています。 b 平衡状態にあり、互いに急速に交換するHR1の2つの（直線およびねじれた）脂質結合立体配座のリボン表示。 Q954H 変異により、ねじれた立体構造の数が増加します。 c 残基特異的 HX 速度および (d) pH 7 で正規化した HR1WT (青) および HR1Q954H (赤) の対応する保護係数。保護係数 1 (破線) は、水素交換からの保護がない、つまり、保護されていないことに対応します。分子内水素結合の重要な集団。データは、100 mM ジミリストイルホスファチジルコリン (DMPC)/ジヘキサノイルホスファチジルコリン (DHPC) (q ～ 0.5) の存在下で 100 μM [15N/2H]-HR1Q954H で得られました。 HR1WTのデータは以前の作品25から再現されています。 e 4 M 尿素の存在下（CoreWT-blue および CoreQ954H-red）の非存在下（CoreWT-black および CoreQ954H-olive）での 10 µM Core の遠紫外 CD スペクトルの重ね合わせ。 f 4 M 尿素の存在下で CD によって観察された CoreWT (青) と CoreQ954H (赤) の熱融解。 CoreWT と CoreQ954H の融解温度はそれぞれ 88 °C と 90 °C です。

以前に報告されたクライオ EM 研究 28 と一致して、溶液中では、コア構築物 (短い柔軟なリンカーによって接続された HR1 と HR2) によって形成される融合後の状態の 6HB の構造は、Q954H 変異によって大きな影響を受けないことがわかりました 29 。 6HB状態のWTとQ954Hの両方の遠紫外CDスペクトルは、208 nmと222 nmに2つの最小値を持つ同じ特徴的なαヘリックスの特徴を示します（図5e）。 WT 変異体と Q954H 変異体間の熱力学的安定性の差異を排除するために、熱融解曲線を 222 nm で監視しました。実際の融解温度は 100 °C をはるかに超えていたため、2 つの構築物の定量的な比較を行うために変性剤の存在下で実験が行われました。興味深いことに、かなり高濃度の変性剤、4 M 尿素の存在下でも、6HB の二次構造は、WT と変異体の両方でほとんど乱れないようです（図 5e）。 WTおよびQ954Hでは88℃および90℃の融解温度が測定され、2つのコンストラクト間の融合後の6HB状態の安定性に有意な差がないことが示唆されました（図5f）。

最近の論文では、SARS-CoV-2 が細胞に感染するためには酸性 pH が必要であることが報告されています 30。したがって、酸性化中にプロトン化状態を変化させることができるH954が、そのイミダゾール部分が関与するpH依存性の6HB安定化相互作用に関与しているかどうかを調査しました（補足図8）。このような相互作用により、その pKa 値は 6.5 から逸脱しますが、これは構造安定化相互作用が存在しない場合に適用されます 31。実験的に決定された H954 の値、pKa = 6.4 は、膜融合に関連する pH 範囲全体で 6HB 状態にそのような相互作用が存在しないことを示しています。

融合前と融合後の両方の状態における SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の構造が、cryo-EM32 によって解明されました。さらに、融合後状態の HR1 および HR2 の 6HB 構造は、変異体についてさらに特徴付けられています 28。これらの構造に基づいて、上記の 6 つの変異をモデル化し、ウイルス融合の状況におけるスパイクタンパク質の構造と機能に対するそれらの潜在的な影響を評価しました (図 6)。これらの変異の位置は、Sの単量体構造上に示されています（図6a）。 T547K 変異はサブドメイン 1/2 に位置し、D389 と塩橋を形成します (図 6b)。この効果は、D614G および P681H 変異のように、S1/S2 相互作用を変化させ、S1/S2 切断に影響を与える可能性があります 20、22、24。 S1/S2切断部位近くのH655Y変異は、他の隣接するアミノ酸と複数の相互作用を形成する可能性があり(図6c)、これによりS1/S2切断が変化すると考えられる。この変異が、受容体結合後のその後の S2' 切断に影響を与える可能性もあります。 S2ドメインのN856K変異はS1のD568と塩橋を形成する可能性があり、S1/S2相互作用に影響を与え、S1/S2切断を減少させる可能性があります（図6d）。 Q954H 変異は HR1 にあります。ヒスチジン変異ではなく野生型グルタミンはR1014と水素結合を形成する可能性があり（図6e）、これによりS2ドメインの微妙な構造変化が引き起こされ、S1 / S2切断の効率が低下する可能性があります。 HR1 の N969K 変異は溶媒を示しており、融合前三量体構造内の他のアミノ酸と相互作用しません。ただし、この変異は依然として S1/S2 切断を減少させる可能性があります (図 4)。この変異は S2 の立体構造に微妙な影響を及ぼし、その結果 S1/S2 切断効率が低下する可能性があります。 HR1 の遠位領域にある L981F 変異は、分子間相互作用に目立った影響を与えません。したがって、S1/S2 切断に対するその影響については十分な説明がありません。

密接な立体構造をした BA.1 スパイクモノマータンパク質のリボン表示。 S1 ドメインは青色で表示され、S2 ドメインは灰色で表示されます。変異はボールで表示され、O、N、C 原子がそれぞれ赤、青、茶色で色付けされています。 b WTおよびBA.1におけるT547Kの変異。三量体タンパク質は、灰色 (S2) とシアン (S1) のリボンで示されています。 BA.1 の K547 と D389 の間に形成された H 結合は赤い点線で示されています。 c S1/S2 切断部位における H655Y の変異 (G614)。 H655Y と F643 の間の芳香族スタッキング相互作用が示されていますが、BA.1 では Y655 と T696 の間に追加の水素結合が形成されています。 d 武漢およびBA.1変異体で観察されたN856Kの変異。 K856 は D568 と塩橋を形成します。 e 武漢における Q954H の変異および BA.1。 Q954 は R1014 と水素結合を形成しますが、H954 は形成しません。 f HR1ドメイン(灰色)のQ954H、N969K、およびL981Fの変異は、融合後6HB構造のHR2ドメイン(シアン)の残基とH結合相互作用を形成します。

最後に、Q954H、N969K、および L981F 変異は HR1 ドメインに存在し、HR2 とともに融合後の構造で 6HB を形成します。それらは 6HB の安定性、ひいては融合形成性に影響を与える可能性があります。最近の研究では、SARS-CoV-2 変異体の融合後のスパイクバンドルの構造を評価し、野生型タンパク質と比較して 3 つの変異を含むタンパク質の 6HB 構造がわずかに変位していることが示されました 28。両方のアミノ酸が別のS2のHR2のS1175と水素結合を形成できるため、Q954H変異は6HB構造を混乱させるとは予測されません（図6f）。上記の NMR データでも、6HB の安定性に対する Q954H の顕著な影響は示されませんでした。エンドソームの酸性 pH 条件下では、H954 がプロトン化されて 6HB 構造に影響を与える可能性があるように見えますが、溶液 NMR データではその pKa の乱れは示されませんでした。アスパラギンとリジンの側鎖が実質的に異なるため、N969K 変異は 6HB 構造を混乱させる可能性があります。 6HB構造では、アスパラギン（野生型）の側鎖は、G1167の骨格の酸素および窒素と一対の水素結合を形成することができ、これはリジン（変異体）のプロトン化側鎖と単一の水素結合を形成する可能性があります（図6f）。）。 L981F 変異と N969K 変異は融合活性に対して反対の効果を有するため、6HB 構造に対する L981F の効果はおそらく N969K の効果を打ち消し、解決された構造における両方の変異のわずかな置換のみをもたらします 28。現在入手可能な 6HB の構造では、L981F 側鎖密度は十分に解明されていないため、変異の影響を確実に言うことは困難です 28。しかし、HR2のS1161はL981の主鎖酸素と水素結合を形成するが、F981とは水素結合を形成しない可能性があることを示唆しています（図6f）。

2021 年末以降、Omicron (BA.1) とその亜亜種が出現して世界中に広がり、主要な亜種となりました 33,34,35。 BA.1 変異株は急速に蔓延するため、感染力と伝播力がより強いと考えられていました。しかし、in vitro 研究では、依然として物議を醸しているものの、初期の系統のような明確な感染力の増加は示されていません。実際、BA.1 は多くの研究で感染性が低いようです 13,36。 BA.1 の伝達率の増加は、ACE2 受容体に対するスパイクタンパク質の親和性の増加、および/または集団内の既存の抗体に対する感受性の低下の結果である可能性があります 37、38、39、40。実際、多くの変異 (>30) がスパイクタンパク質に存在し、N 末端および受容体結合ドメインと S2 タンパク質を含む S1 タンパク質に広く分布しています 11、12、41。一方、BA.1 は初期の系統と比較して病原性の弱毒化を示すようです 37、38、39、40。ここで我々は、BA.1 が B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2 変異体を含む初期のすべての系統よりも融合誘発性が大幅に低いことを示しました。我々は、融合原性の低下がBA.1の病原性の低下に寄与している可能性が高いと推論した。これまでの研究では、SARS-CoV-2 の融合特性が SARS-CoV-242,43 の発症に寄与する要因の 1 つであることが裏付けられています。最近の報告では、スパイクを介した融合がカスパーゼ 9 経路を活性化し、その結果、カスパーゼ 3/7 およびガスダーミン E を介したピロトーシスが活性化されることが示唆されています 43。

この研究では、我々は、融合表現型の弱毒化の原因となる可能性のあるスパイクタンパク質の BA.1 関連変異を調べました。我々は、S1 タンパク質の変異が ACE2 結合の増加と抗体逃避に関連している可能性が高いと推論しました。ただし、S1 タンパク質の変異が融合誘導性に影響を与える可能性があります。実際、S1 タンパク質の変異の一部は、ACE2 結合の増加と抗体回避だけでなく、融合原性にも関与していることが報告されています 22,44,45,46。 S1 タンパク質の変異の一部は融合誘発性に関与している可能性がありますが、サブドメイン 1/2、S1/S2 切断部位の周囲、または HR1 を含む S2 配列に位置する 9 つの変異に焦点を当てることにしました。変異は、BA.1 亜変異体の多くで一般的に観察されました。私たちは、これらの変異を研究することで、BA.1 とそのサブバリアントの融合誘発性と病原性についての機構的な洞察が得られる可能性があると推論しました。 D614G および P681H は、これら 2 つの変異がすでに十分に特徴付けられているため、研究されませんでした。 D614G 変異は感染力を強化しますが、融合原性は親の武漢株のレベルに匹敵します 47,48。 P681H 変異は融合活性の増加に寄与すると報告されています 22。

9 つの変異のうち、5 つ (T547K、H655Y、N856K、Q954H、および N969K) が BA.1 の融合誘発性の減弱に寄与していることがわかりました。興味深いことに、1 つの変異 (L981F) は逆の融合誘導効果を示し、これにより、組み合わせた 5 つの変異の全体的な融合誘導性が低下します。この変異は、他の変異の大幅に低下した融合誘発性を補うために出現した可能性があるため、ウイルスは引き続き感染力を持ちます。我々は、融合誘導性の減弱に関与する 5 つの変異が S1/S2 切断効率の低下を示していることを観察しましたが、これは構造モデリングによって説明できる可能性があります。最近の論文では、H655Y 変異がより高い融合活性を与え、S1/S2 切断を増加させることが示されました 9 が、これは我々の発見とは異なります。その研究では、著者らは 1 つの細胞株のみをテストしました。ここでの私たちの研究では、複数の細胞株で実験を繰り返してテストしました。したがって、違いはわかりません。

上述のように、N856K、Q954H、N969K 変異は融合前状態の S タンパク質の構造に影響を及ぼし、S1/S2 切断の減少を引き起こす可能性があります。 NMRおよびCD分析に基づくと、Q954H変異は別の効果、すなわちHR125の脂質結合中間構造アンサンブルの平衡分布をシフトさせる可能性があり、ウイルス融合に悪影響を与える可能性がある。ウイルス融合に対する Q954H、N969K、および L981F の全体的な影響は、より複雑である可能性があります。 S1/S2 切断に対するそれらの効果に加えて、それらは 6HB 融合後構造を形成する必須のステップにおける融合プロセスにも影響を与える可能性があります。私たちの発見は、これらの突然変異の影響が複雑で絡み合っていることを総合的に示唆しています。一部の変異は、他の変異と関連してエピスタティック効果を有する可能性があります。

B.1.1.7、B.1.351、および B.1.617.2 変異体の融合活性は、それらの高い感染力に比例します。 BA.1 は、S1 ドメインと S2 ドメインの両方に多くの突然変異が出現しており、以前の系統と比較して動作が異なります。 S1 ドメインの変異はスパイクと ACE2 の間の親和性の向上に寄与している可能性があり、これにより S2 ドメインの変異によって付与された融合誘導性の減弱が補われると考えられます。他のBA.1サブバリアントの感染力は、偽型ウイルスシステムに基づくと、Omicron BA.1の感染力よりも低いようです（補足図5）。これらのBA.1バリアントの配列を比較すると（補足図1）、BA.1は他のサブバリアントと比較してS1ドメインに独特の変異パターンを持っていることが示されており、これがBA.1のより高い感染力を説明している可能性があります。

出現した SARS-CoV-2 変異体は、この領域のエスケープ変異のせいで、S1 ドメインの RBD を標的とする承認された中和モノクローナル抗体の影響を受けにくいようです 49。 SARS-CoV-2 に対する治療抗体の開発における最近の取り組みは、ウイルス融合を媒介する S2 ドメインのより保存された融合ペプチド/ステムヘリックス構造に焦点を当てています 50,51。融合プロセスに影響を与える多数の変異をもつ Omicron 変異体は、感染集団における S2 に対する天然抗体に反応して出現した可能性があり、おそらくこの代替クラスの中和抗体に対する感受性が低いのではないかと推測したくなります。

私たちの研究は、世界中で主要なウイルス変異体となっている BA.1 変異体のスパイクタンパク質におけるさまざまな変異の、興味深いながらも複雑な相互作用を明らかにしました。これらの変異株は、パンデミックの2年半後、集団ベースのワクチン接種または広範な感染によって引き起こされた、ウイルスに対する免疫が増加しつつある状況で出現した可能性が高い。進化の圧力により、既存の免疫の影響を受けにくい変異体が選択されることが予想されましたが、興味深いことに、オミクロンのような毒性の低い変異体も選ばれました。インフルエンザウイルスは、そのヘマグルチニンのフリン切断部位を変異させて、ウイルスの指向性と病原性を変化させることが知られている52。毒性の低いSARS-CoV-2変異種は集団レベルでより感染しやすいのではないかと推測するのは興味深い。なぜなら、感染者は症状が少なく、自分の感染を認識していないため、特に感染がそれほど厳しくない場合には、他の人に感染しやすいからである。 - 過去 1 年間の予防策を管理する。 SARS-CoV-2は進化を続け、風邪ウイルスのように毒性がさらに弱くなり、変異し、適応し、集団内に蔓延する可能性がある。高病原性ウイルスが感受性の高い宿主集団に導入されると、宿主と共進化して宿主の微生物界に恒久的な足場をさらに確立できるのではないかと推測するのは興味深い。

HeLa、Vero E6、および CaCo-2 細胞 (HeLa、CCL-2、Vero E6、CRL-1586、CaCo-2、HTB-37、ATCC、バージニア州マナッサス、米国) を EMEM (バージニア州マナッサス、ATCC) で培養しました。、米国）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ−３２１６、ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）をＤＭＥＭ（米国ニューヨーク州コーニング、コーニング）中で維持した。 293ACE2 (ACE2 発現細胞)53 および Huh7.5-A2T2 (ACE2 および TMPRSS2 発現細胞、Charles Rice 提供)54 細胞を、293ACE2 に対して 1 μg/mL のピューロマイシンおよび 250 μg/mL の G418 を含む DMEM (Corning) で培養しました。 Huh7.5-A2T2用。 Vero E6-T2 (TMPRSS2 発現細胞、国立衛生研究所国立アレルギー感染症研究所の SARS-CoV-2 コア施設によって提供) 細胞は、200 μg/mL のハイグロマイシン B を含む EMEM (ATCC) で維持されました。 CaCo-2 (20% 熱不活化ウシ胎児血清) を除き、すべての培地に 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (MilliporeSigma、バーリントン、マサチューセッツ州、米国) を補充し、細胞を 37 °C および 5 ℃の温度で維持しました。 % CO2 インキュベーター。

化合物は商業供給元から購入しました: 25-HC (MilliporeSigma)、イトラコナゾール (MilliporeSigma)。 SARS-CoV-2 S タンパク質に対する抗体は、さまざまな販売元から購入しました（抗 S1、カタログ番号: GTX135356、GeneTex、米国カリフォルニア州アーバイン、および抗 S2、カタログ番号: PA5-116917、Thermo Fisher Scientific、Waltham、マサチューセッツ州、米国、カタログ番号: GTX632604、GeneTex) であり、さまざまなウイルス学的アッセイに使用されます。抗β-アクチン (カタログ番号: ab8227、Abcam、ケンブリッジ、英国)、抗 VSV (カタログ番号: REA005、Imanis Life Sciences、ロチェスター、ミネソタ州、米国) 抗体も市販されています。

SARS-CoV-2 S (Genscript、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ) cDNA プラスミドは商業供給元から購入しました。 SARS-CoV-2 の S 配列（ER 保持シグナルを含む）の C 末端は、ウイルス収量を増加させるために 20 アミノ酸が短縮されました 15,55。切断のための終止コドンを導入するために、In-Fusion クローニングキット (Takara、Shiga、JAPAN) を製造業者の指示に従って使用して、ヌクレオチド 3759 (C から A) に単一ヌクレオチド突然変異を作成しました。切断されたＳ配列を使用して、ＢａｍＨＩで消化した後、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号：８４５４）５６プラスミド内のＶＳＶ－Ｇ配列を置換した。 B.1.1.74、B.1.35157、B.1.617.258 変異体の S 配列の変異およびすべての個々の S 変異体は、Q5 部位特異的変異誘発キット (New England BioLabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国) を使用して導入されました。商業ソース (Genscript) によって合成された BA.111,12,41 の場合。組み立てられたプラスミドは、VSV 偽型ウイルスの生成に使用されました。全長 (切断されていない) S コンストラクトも同様に生成されました。 B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2、BA.1、およびそのサブバリアント (BA.2、BA.2.12.1、BA4、BA.5、および BQ.1) の変異部位35 、41を補足図1に示します。

細胞間融合アッセイでは、上記の SARS-CoV-2 S コンストラクトに追加の配列を追加して、短縮型 S-SmBit と短縮型 S-GFP の両方を生成しました。 BamHI で消化された pCMV-VSV-G バックボーンも両方の構築物に使用されました。短縮型 S-SmBit 構築の場合、短縮型 S 配列と P2A-SmBit 配列を PCR で増幅し、製造元の指示に従って In-Fusion クローニングキットを使用して消化されたバックボーンと組み合わせました。短縮型Ｓ−ＧＦＰ構築物の生成のために、上記構築物およびＧＦＰからの短縮型Ｓ配列およびＰ２Ａ配列をＰＣＲによって増幅し、上記のように組み合わせた。 RFPおよびLgBitを発現する構築物は、上記の構築物と同様にIn-Fusionクローニングキットを使用して同様に作製した。

SARS-CoV-2 S タンパク質を介した細胞間融合を測定するために、HeLa 細胞（ドナー）に、GFP 発現プラスミドと融合した S または SmBit 発現プラスミドと融合した切断型 S をトランスフェクトしました14。 SmBit は NanoBit システム (Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) からのもので、発光信号を発するために LgBit とペアになります。 293ACE2 細胞 (レシピエント) に、RFP または LgBit 発現プラスミドをトランスフェクトしました。 FuGENE® 6 Transfection Reagent (Promega) を製造業者の指示に基づいてトランスフェクションに使用しました。 GFP と RFP 間の共局在化により、融合イベントの視覚化が可能になり、融合細胞内の SmBit タンパク質と LgBit タンパク質間の相互作用により、発光シグナルを発する機能的な酵素が提供されます。この SmBit-LgBit システムは、融合イベントの定量化に適しています 14。ネガティブコントロールとして、S-SmBit の代わりに GFP-SmBit コンストラクトを使用しました。簡単に言うと、ドナー細胞とレシピエント細胞を上記の適切なプラスミドでトランスフェクトしました。トランスフェクションの 24 時間後、ドナー細胞とレシピエント細胞をそれぞれ 5 mM EDTA と Accutase で剥がしました。 96 ウェルプレートの各ウェルに、30,000 個のドナー細胞と 15,000 個のレシピエント細胞を播種しました。透明な底の黒色プレート（Corning）を蛍光測定に使用し、白色プレート（Greiner Bio-One、クレムスミュンスター、オーストリア）を発光測定に使用した。次に、両方の細胞を、10% FBS を含む DMEM 中で阻害剤化合物と 48 時間共培養しました。 GFP-RFP 共局在解析では、4 つの複製から 15 ～ 20 のフィールドがランダムに選択され、CellSens 蛍光顕微鏡 (オリンパス、東京、日本) で融合細胞が測定されました。共局在シグナルを定量化するために、ImageJ (米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州) を使用しました。 SmBit-LgBit 評価では、ナノルシフェラーゼ基質 (Furimazine) を添加し、基質添加直後に POLARstar Omega プレートリーダー (BMG LABTECH、Ortenberg、Germany) で発光シグナルを測定しました。 GFP-SmBit コントロールからのバックグラウンドシグナルをすべての実験サンプルから差し引いた。

ウイルスストックは、国立衛生研究所によって策定された SOP に基づいて、適切に指定されたバイオセーフティレベルの実験室で生成、維持、および処理されました。この研究で使用された SARS-CoV-2 変異株は、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所の SARS-CoV-2 コア施設、および BEI リソース (beiresources.org) から提供されました。変異体の参照先は次のとおりです: SVG-001/USA-WA1 (武漢)。 SVG-015 英国/カナダ B.1.1.7; SVG-019 RSA 1.351 501Y; SVG-028 B.1.617.2; SVG −053 BA.1 SARS-CoV-2/ヒト/U SA/HI-CDC-4359259-001/2021。上記のバリアントはすべて、TMPRSS2 を発現する Vero E6-T2 で生成されました。

生ウイルス融合アッセイでは、レンチウイルスベクターによって形質導入された、GFPを発現するHuh7.5-A2T2を、ウェル当たり40,000細胞の密度で96ウェルプレートに播種した。 24時間後、細胞をさまざまなSARS-CoV-2変異体に感染させ、37℃で2時間インキュベートした。感染の2時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。感染の 24 時間後、下流実験のために細胞を 4% PFA (ChemCruz、米国テキサス州ダラス) で固定しました。

独自の VSV-G 糖タンパク質をトランスでシュードタイプ化した組換え VSV は、Adolfo Garcia-Sastre (マウントサイナイ医科大学、ニューヨーク州、米国) によって提供されました 59。天然の G タンパク質配列がホタルルシフェラーゼによって置き換えられ、複製欠陥のある組換えウイルスが生じました。シュードウイルスを生成するために、欠失した天然の G 糖タンパク質を VSV-G 発現プラスミドで補完しました。

さまざまな偽型ウイルスを生成するために、HEK293T 細胞を 10 cm ディッシュあたり 400 万細胞の密度で播種し、プラスミドを発現する SARS-CoV-2 バリアント S 10 μg でトランスフェクトしました。 FuGENE® 6 Transfection Reagent (Promega) を製造業者の指示に基づいてトランスフェクションに使用しました。トランスフェクションの24時間後、細胞をVSV-Gシュードタイプウイルスに感染させ、感染後4時間で培地を洗浄し、新しい培地に交換した。 SARS-CoV-2 変異型 S シュードタイプウイルスは感染後 24 時間で収集されました。ウイルスを含む培地を 0.22 μm シリンジフィルターで濾過し、-80 °C で保存しました。

偽型ウイルス感染力アッセイでは、標的細胞を白色の 96 ウェルプレートにウェルあたり 15,000 細胞の密度で播種しました。感染前に、ＶＳＶＬｍＲＮＡレベルを測定して、偽型ＶＳＶストックの体積あたりのゲノムコピー数を計算した。次に、同じゲノムコピー数を細胞に接種しました。播種から 24 時間後、細胞を同量の偽型ウイルスに感染させました。感染の 24 時間後、細胞を Promega レポーター溶解バッファー (Promega) で 30 分間溶解し、その後 -80 °C まで凍結融解サイクルを繰り返しました。 Amplite™ ルシフェラーゼレポータージーンアッセイキット (AAT Bioquest、米国カリフォルニア州サニーベール) を製造業者の指示に従ってルシフェラーゼ活性測定に使用しました。発光シグナルは、POLARstar Omegaプレートリーダー(BMG LABTECH)によって測定した。

タンパク質抽出では、RIPA 溶解および抽出バッファー (Thermo Fisher Scientific) とプロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche、バーゼル、スイス) を混合し、室温で 10 分間細胞サンプルの溶解に使用しました。溶解サンプルを 12,000 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離し、上清を分離しました。上清は、Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) によるタンパク質の定量に使用されました。標的タンパク質を定量するために、Simple Western™ Automated Western Blot System (Bio-Techne, Minneapolis, MN, USA) を製造元の指示に従って使用し、自動ウェスタンブロットを実行しました。トリミングされていないすべての画像データを補足図9に示します。

SARS-CoV-2コアのQ954H変異体（HR1 + HR2）およびHR1（図5a）の遺伝子インサートを合成し、以前に記載されているようにpJ414ベクター（ATUM）にクローニングしました25。 WT および変異体を大腸菌 BL21 (DE3) 中で 37 °C で増殖させ、光学密度 (600 nm) 0.8、最終濃度 2 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシドで 4 時間発現誘導しました。 HR1 WT とその Q954H 変異体は、Ni-ニトリロ酢酸 (Ni-NTA) アフィニティーおよび逆相高圧液体クロマトグラフィー技術を使用して精製されました。これには、以前に記載されているように、TEV プロテアーゼによる N 末端 His6 タグの除去も含まれます 25。コア WT とその Q954H バリアントを Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーによる変性条件下で精製し、非変性バッファー (20 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6)、150 mM) 中でサイズ排除クロマトグラフィーカラム (Superdex-200) 上でフォールディングしました。塩化ナトリウム、および5 mMイミダゾール）25．コア構築物は、N 末端に His6 タグを保持していました。

遠紫外 CD スペクトルは、30 mM 塩化ナトリウムを含む 20 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6) 中の 0.1 cm 光路長キュベットを使用して JASCO J-810 分光旋光計で取得しました。 100 °C 未満の温度で変性しなかったコアのサンプルについては、4 M 尿素を添加した後の安定性を調べました。測定は 10 μM タンパク質サンプルに対して実行されました。 CD 融解曲線は、25 ～ 95 °C の温度範囲にわたって 222 nm で監視され、毎分 1 °C の昇温速度で取得されました。

HX 速度は、30 mM 塩化ナトリウムおよび 1 mM イミダゾールと 33 mM DMPC と 67 mM DHPC、一般にバイセルと呼ばれる円盤状の混合ミセルを形成する脂質混合物 60,61。 HX 速度は、5 秒のリサイクル遅延 (d1) と 5 ～ 1000 ミリ秒の範囲の水反転間隔の 7 つの持続時間を使用する WEX-III TROSY 実験 62 を使用して測定されました。測定は、800 MHz 分光計を使用して 30 °C で実行されました。固有のランダムコイルの HX レートは、SPHERE ウェブサーバー 27 から取得されました。サンプルの pH 値は、イミダゾール 1H 化学シフトから得られました63。

H954 の pKa は、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液および 30 mM NaCl 中に 0.15 mM [15N/2H]-CoreQ954H を含むサンプルの一連の 1H-15N TROSY-HSQC スペクトルから、サンプルの pH を段階的に変化させることによって決定されました。 5.0 ～ 7.6 の範囲。 pKa は、式 63 を使用して 1H および 15N 化学シフトから抽出されました。

ここで、δobs は対象ピークの観察された NMR 化学シフト、δHA およびδA はプロトン化および脱プロトン化された形の化学シフトです。

HeLa 細胞を SARS-CoV-2 バリアント S プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの 48 時間後に 4% パラホルムアルデヒド (ChemCruz) で固定しました。固定後、細胞をＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ－１００で透過処理し、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）によってブロックした。抗 S2 (カタログ番号: GTX632604、GeneTex) を 0.1% Triton X-100 および 1% BSA 含有 PBS で希釈しました。 Alexa Fluor 555 ロバ抗マウス IgG (Thermo Fisher Scientific) を二次抗体として細胞に添加しました。核染色にはDAPI（Thermo Fisher Scientific）を使用しました。画像は、Zeiss LSM 700 共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ) によって撮影されました。

PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit (AAT Bioquest) を使用して、さまざまな SARS-CoV-2 バリアント S プラスミドをトランスフェクトした標的細胞の生存率を測定しました。 HeLa 細胞を SARS-CoV-2 バリアント S プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの 24 時間後にウェルあたり 10,000 細胞の密度で白色の 96 ウェルプレートに移しました。さらに24時間後、POLARstar Omegaプレートリーダー(BMG LABTECH)でルシフェラーゼ活性を評価した。

武漢および BA.1 の SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の構造は、クライオ EM によって解析され、PDB ID 7DZW (武漢)、7WK2 (BA.1、S-close)、および 7WK2 (BA.1、S-close) でタンパク質データバンクから取得されました。 7WVN (BA.1、S-オープン)。モデリング解析の前に、MOE プログラムを使用して武漢と変異型三量体タンパク質の構造を精密化し、重ね合わせました。さらに、融合後状態の HR1 および HR2 の 6HB 構造も特徴付けられています 28。武漢 (7RZV) と BA.1 (7TIK) は両方とも PDB から取得され、構造研究に使用されました。水素結合、塩橋などのさまざまな分子間相互作用を定義するには、Discovery Studio Visualizer ソフトウェアを使用しました。

データはGraphPad Prism 9ソフトウェア（GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）で分析され、3回以上の実験反復の平均（SD）として示されました。必要に応じて一元配置分散分析多重比較用に調整した両側 P 値を分析に使用し、P 値 < 0.05 を統計的に有意であるとみなしました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。各統計結果を導き出すために使用されたサンプルサイズは、該当する図の凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

グラフの数値ソースデータは補足データにあります。この研究を裏付けるデータは、要求に応じて責任著者から入手できます。

セレ、Ｓ．ら。オミクロンはファイザー BNT162b2 中和を広範囲に、しかし不完全に回避します。ネイチャー 602、654–656 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

世界保健機関。 SARS-CoV-2 変異体の追跡。 https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants (2022)。

Guo、H.ら。 Omicron スパイク複合体の構造と中和抗体の開発への影響。 Cell Rep. 39、110770 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng、B.ら。 SARS-CoV-2 スパイク欠失 H69/V70 の再発とアルファ変異体 B.1.1.7 におけるその役割。 Cell Rep. 35、109292 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mlcochova、P.ら。 SARS-CoV-2 B.1.617.2 デルタ変異体の複製と免疫回避。ネイチャー 599、114–119 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Akatsuki, S.、Takashi, I.、Rigel, S.、Tadashi, M. SARS-CoV-2 デルタ P681R 変異の融合原性と病原性の強化。ネイチャー 602、300–306 (2022)。

記事 Google Scholar

Dejnirattisai、W. et al. 免疫後血清による SARS-CoV-2 オーミクロン B.1.1.529 バリアントの中和の減少。ランセット 399、234–236 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウォルター、N.ら。南アフリカにおけるSARS-CoV-2ミクロン変異体の臨床重症度の早期評価：データ連携研究。ランセット 399、437–446 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エスカレラ、A. et al. 懸念される SARS-CoV-2 変異株の変異は、スパイク切断とウイルス感染の増加に関連しています。 Cell Host Microbe 30、373–387.e7 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng、B.ら。 SARS-CoV-2 オミクロンによる TMPRSS2 の使用の変化は、感染力と融合原性に影響を与えます。ネイチャー 603、706–714 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Planas, D. et al. SARS-CoV-2 オミクロンが抗体中和にかなり回避。ネイチャー 602、671–675 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cao、Y.ら。オミクロンは既存の SARS-CoV-2 中和抗体の大部分を回避します。ネイチャー 602、657–663 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

鈴木良ほか SARS-CoV-2 オミクロン変異体の融合原性と病原性が弱められています。ネイチャー 603、700–705 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パーク、SBら。小分子阻害剤による SARS-CoV-2 感染の融合プロセスの標的化。 MBio 13、e0323821 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

ケース、JB 他複製能力のあるVSV-SARS-CoV-2およびSARS-CoV-2の臨床分離株の中和抗体および可溶性ACE2阻害。 Cell Host Microbe 28、475–485.e5 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zang、R.ら。コレステロール 25-ヒドロキシラーゼは、膜融合をブロックすることで SARS-CoV-2 の複製を抑制します。手順国立アカド。科学。 USA 117、32105–32113 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lamers, MM、Mykytyn, AZ、Breugem, TI、Groen, N. & Knoops, K. SARS-CoV-2 オミクロンはヒトの気道に効率的に感染しますが、肺胞上皮には感染しません。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.01.19.476898 (2022)。

チウ、MC 他気道上皮の両能性オルガノイドモデルは、SARS-CoV-2 オミクロン変異体の高い感染力を再現します。セル発見。 8、1–15 (2022)。

記事 Google Scholar

Buchrieser, J. et al. SARS-CoV-2 感染細胞による合胞体形成。 EMBO J. 39、1–12 (2020)。

記事 Google Scholar

斉藤明ほか SARS-CoV-2 デルタ P681R 変異の融合誘発性と病原性の強化。ネイチャー 602、300–306 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Du、Xら。 Omicron は、Delta や他の亜種とは異なる戦略を採用してホストに適応します。信号伝達。目標。それで。 7、5–7 (2022)。

Google スカラー

ラジャ、MM 他 SARS-CoV-2 のアルファ、ベータ、デルタの変異体は、スパイクを介した合胞体形成の強化を示します。 EMBO J. 40、1–17 (2021)。

記事 Google Scholar

Wrobel, AG et al. SARS-CoV-2 とコウモリの RaTG13 スパイク糖タンパク質の構造は、ウイルスの進化とフリン切断効果について情報を提供します。ナット。構造体。モル。バイオル。 27、763–767 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、YWら。 sars-cov-2 スパイクタンパク質の D614g 置換は、フリン媒介スパイク切断の強化を介してシンシチウム形成とウイルス力価を増加させます。 MBio 12、e0058721 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Chiliveri, SC、Louis, JM、Ghirlando, R. & Bax, A. スパイクタンパク質の 7 アミノ酸リピートの一時的な脂質結合状態は、SARS-CoV-2 の膜融合に関する洞察を提供します。科学。上級 7、1–14 (2021)。

記事 Google Scholar

イングランダー、SW、ダウナー、NW、タイテルバウム、H. 水素交換。アンヌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 903 ～ 924 年。 https://doi.org/10.1038/nsb0901-741 (1972)。

Bai, Y.、Milne, JS、Mayne, L.、Englander, SW ペプチド基の水素交換に対する一次構造の影響。タンパク質の構造。機能。バイオインフォマ。 17、75–86 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

ヤン、Ｋ．ら。 SARS-CoV-2 スパイク融合後バンドルの変異体間の構造の保存。手順国立アカド。科学。 USA 119、1–9 (2022)。

Google スカラー

サン、Ｈら。 HCoV-19融合コアの構造基盤とウイルス侵入に対する効果的な阻害ペプチド。出現。微生物が感染します。 9、1238–1241 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クロイツバーガー、AJB et al. SARS-CoV-2 が細胞に感染するには、酸性の pH が必要です。手順国立アカド。科学。 USA 119、1–12 (2022)。

記事 Google Scholar

Grimsley, GR、Scholtz, JM & Pace, CN 折りたたまれたタンパク質のイオン化可能基の測定された pK 値の概要。タンパク質科学。 18、247–251 (2009)。

CAS PubMed Google Scholar

Cai、Y.ら。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の異なる立体構造状態。科学 (80-.)。 369、1586–1592 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Shrestha, LB、Foster, C.、Rawlinson, W.、Tedla, N. & Bull, RA SARS-CoV-2 オーミクロン変異体 BA.1 から BA.5 の進化：免疫逃避と感染への影響。医学牧師ヴィロル。 32、e2381 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian, D.、Sun, Y.、Xu, H. & Ye, Q. 高度に変異した SARS-CoV-2 オミクロン変異体の出現と流行の特徴。 J.Med. ヴィロル。 94、2376–2383 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu、P. et al. SARS-1 CoV-2 オミクロンサブバリアント BQ.1、BQ.1.1、BA.4.6、BF.7、および BA.2.75.2 の明確な中和抗体エスケープ。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.19.512891 (2022)。

パストリオ、C.ら。 SARS-CoV-2 Omicron サブバリアント BA.1 および BA.2 における Spike の感染力、プロセシング、および中和の決定因子。 Cell Host Microbe 30、1255–1268.e5 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shuai, H. et al. SARS-CoV-2 B.1.1.529 オミクロンの複製と病原性の減弱。ネイチャー 603、693–699 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bálint, G.、Vörös-Horváth, B. & Széchenyi, A. Omicron: 感染力の増加と病原性の減少。信号伝達。目標。それで。 7、2–4 (2022)。

Google スカラー

サン、Ｋら。 SARS-CoV-2 の伝播、免疫の持続、南アフリカの人口コホートにおけるオミクロンの影響の推定。科学。翻訳。医学。 14、eabo7081 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

サイード、AM et al. オミクロンの変異は感染力を高め、SARS-CoV-2 ウイルス様粒子の抗体中和を減少させます。手順国立アカド。科学。 USA 119、1–7 (2022)。

記事 Google Scholar

Cao、Y.ら。 BA.2.12.1、BA.4、および BA.5 は、Omicron 感染によって誘発される抗体から逃れます。ネイチャー 608、593–602 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rajah, MM、Bernier, A.、Buchrieser, J. & Schwartz, O. SARS-CoV-2 スパイク媒介融合およびシンシチウム形成のメカニズムと結果。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 434、167280 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ma、H.ら。 SARS-CoV-2 スパイク細胞と ACE2 発現細胞の融合によって形成される合胞体のパイロトーシス。セル発見。 7、7–10 (2021)。

記事 Google Scholar

Hoffmann, M.、Zhang, L. & Pöhlmann, S. Omicron: 免疫回避の達人は、強力な ACE2 結合を維持します。信号伝達。目標。それで。 7、2–4 (2022)。

Google スカラー

木村一等 SARS-CoV-2 スパイク S375F 変異は、Omicron BA.1 変異体の特徴です。 iScience 25、105720 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, Y. 他 Ins215KLRS および H655Y の非 RBD 変異による、N501Y 保有マウスの SARS-CoV-2 感染力の長距離増強。バイオル。ダイレクト 17、1–11 (2022)。

記事 Google Scholar

コーバー、B.ら。 SARS-CoV-2 スパイクの変化の追跡: D614G が COVID-19 ウイルスの感染力を高める証拠。セル 182、812–827.e19 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

大薗伸ほか SARS-CoV-2 D614G スパイク変異は、ACE2 結合親和性を高めて侵入効率を高めます。ナット。共通。 12、848 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

テネシー州スターら SARS-CoV-2 受容体結合ドメインの詳細な変異スキャンにより、フォールディングと ACE2 結合の制約が明らかになりました。セル 182、1295–1310.e20 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dacon, C. et al. ステムヘリックスを標的とする稀な収束抗体は、多様なベータコロナウイルスを広範囲に中和します。細胞宿主微生物 1-15. https://doi.org/10.1016/j.chom.2022.10.010 (2022)。

Dacon, C. et al. 広範な中和抗体はコロナウイルス融合ペプチドを標的とします。科学 (80-.)。 377、728–735 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Sun, X.、Tse, LV、Ferguson, AD & Whittaker, GR 血球凝集素切断部位の修飾は、神経向性 H1N1 インフルエンザウイルスの毒性を制御します。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 84、8683–8690 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、Q.ら。ヘパラン硫酸は SARS-CoV-2 の細胞侵入を助け、in vitro で承認された薬剤の標的となる可能性があります。セル発見。 6、80（2020）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ricardo-Lax, I. et al. SARS-CoV-2 レプリコンの複製とシングルサイクル配信。科学。 374、1099–1106 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シオン、HLら。 SARS-CoV-2 S タンパク質保有水疱性口内炎ウイルス (VSV) シュードウイルスおよび ACE2 過剰発現 BHK21 細胞に基づく堅牢な中和アッセイ。出現。微生物が感染します。 9、2105–2113 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スチュワート、SA et al. 初代細胞における RNAi によるレンチウイルスによる安定した遺伝子サイレンシング。 Rna 9、493–501 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Villoutreix, BO、Calvez, V.、Marcelin, AG、Khatib, AM ace2 に焦点を当てた英国 (B.1.1.7) および南アフリカ (501y.v2) の新しい SARS-CoV-2 変異株のインシリコ調査–スパイク rbd インターフェイス。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 22、1–13 (2021)。

記事 Google Scholar

Planas, D. et al. SARS-CoV-2 バリアントデルタの抗体中和に対する感受性の低下。 Nature 596、276–280 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tscherne, DM & García-Sastre, A. ウイルス侵入を検出するための酵素アッセイ。カー。プロトック。セルバイオル。 https://doi.org/10.1002/0471143030.cb2612s51 (2011)。

グローバー、KJ 他膜関連生体分子の溶液状態研究のためのリン脂質バイセルの構造評価。生物物理学。 J. 81、2163–2171 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prosser, RS、Evanics, F.、Kitevski, JL & Al-Abdul-Wahid, MS 膜結合両親媒性物質およびタンパク質の NMR 研究におけるバイセルの現在の応用。生化学 45、8453–8465 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fitzkee, NC、Torchia, DA & Bax, A. ホモ二量体 36 kDa HIV-1 インテグラーゼ触媒コアドメインにおける急速な水素交換の測定 (Protein Science (2011) 20, (500-512))。タンパク質科学。 1643 年 20 日 (2011 年)。

論文 CAS PubMed Central Google Scholar

Baryshnikova, OK、Williams, TC & Sykes, BD 生体分子 NMR 用の内部 pH 指示薬。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 41、5–7 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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Huh7.5-A2T2 細胞を共有してくれた Charles Rice (The Rockefeller University, New York, NY, USA) と組換え体を共有してくれた Adolfo Garcia-Sastre (Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA) に感謝します。天然のVSV-G糖タンパク質で偽型化されたVSV。また、米国ベセスダの国立衛生研究所、国立アレルギー感染症研究所のSARS-CoV-2中核施設にも感謝いたします。この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の学内研究プログラム、NIHの学内標的抗COVID-19プログラム、および国立トランスレーショナルサイエンス推進センター（国立衛生研究所）の学内/学外プログラムによって支援されました。、米国）。

国立衛生研究所 (NIH) によって提供されるオープンアクセス資金。

国立衛生研究所、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所（NIDDK）肝臓疾患部門、ベセスダ、メリーランド州、20892、米国

スンボム・パーク、モーシン・カーン、パーカー・アービン、マデリーン・リーク、アイリス・グリーシェイバー、ゾンイー・フー、ウン・ソン・ジャン、T・ジェイク・リャン

化学物理学研究所、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所 (NIDDK)、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、20892、米国

サイ・チャイタンヤ・チリヴェリ & アド・バックス

トランスレーショナルサイエンス推進国立センター (NCATS)、国立衛生研究所、ロックビル、メリーランド州、20850、米国

シン・フー

ソウル国立大学盆唐病院内科、ソウル国立大学医科大学、城南、13620、大韓民国

チャン・ウンソン

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概念化、SBP および TJL。調査、SBP、MK、SCC、XH、PI、ML、AG、ZH、ESJ、AB; 執筆 – 原案、SBP。執筆 – レビューおよび編集、TJL。資金調達、TJL

Seung Bum Park または T. Jake Liang への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Zhijuan Qiu と David Favero。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

パーク、SB、カーン、M.、チリヴェリ、SC 他。 SARS-CoV-2 のオーミクロン変異体は、融合表現型の減弱の原因となるスパイクタンパク質変異を抱えています。 Commun Biol 6、556 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04923-x

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受信日: 2022 年 12 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 8 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04923-x

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